WB marker 条带发黑

最近做了几次WB，情况基本一致。同一张膜，一抗孵育His标签抗体时，蛋白marker发黑，如第一张图。而同一张膜敷别的抗体，marker泳道则正常。怀疑是His抗体问题，买了新的CST的，结果一样。

图一二为同一张膜剪切的

图一

图二

WB条件如下：

第一张图，marker中间两泳道，分别为对照和实验组。实验组为过表达基因A，mRNA水平显著提高。蛋白A大小约为33kDa，没有商业化抗体，所以用标签去拉。

10%和12%的下层胶都试过

电泳：80v转120v

转膜：300mA 湿转2h

5%脱脂奶封闭2.5h，封闭结束后没有进行洗膜和不洗膜，结果一样。

一抗His  1:1000/ 1:2000（碧云天的一抗稀释液），四度过夜

洗膜3次，每次10-15min

二抗1:5000（5%脱脂奶稀释），室温1h

洗膜同上。

曝光

请各位大神指教，到底是什么原因？感谢！