细胞膜修饰的纳米载体与肿瘤免疫治疗

摘要： 纳米载体由于其纳米尺度带来的独特生物功能性,可通过特定设计在生物体内靶向递送各类抗肿瘤药物,具有广泛而重要的应用前景。自肿瘤免疫疗法问世之后,各类纳米载体与肿瘤免疫治疗相结合,逐渐成为提升肿瘤免疫治疗效果的重要手段之一。其中,细胞膜修饰的纳米载体作为一类新型仿生药物载体平台,可使纳米载体获得天然细胞膜的伪装修饰,将细胞膜的特定功能与生物特性转移至纳米载体,使其具有更强的抗免疫清除、血液长循环和肿瘤靶向等特性,同时降低纳米递送系统的免疫原性和细胞毒性,在生物医学应用领域尤其是肿瘤免疫治疗中可发挥更大的作用。本文通过结合免疫治疗的机理,对近年来各种细胞膜修饰纳米载体系统的制备方法、作用机制以及在肿瘤免疫治疗中的应用研究进行综述,并在此基础上对未来的相关探索做出了展望。

目前,肿瘤(癌症)依旧是世界上最难以治愈的疾病之一。传统的肿瘤治疗方法主要分为三类:外科手术疗法、化学疗法和放射疗法。外科手术治疗,即通过外科手术切除体内肿瘤,对未扩散的早期肿瘤治疗效果较好,但随着恶性肿瘤发展和转移,对于中晚期肿瘤则疗效和预后较差;化学疗法和放射疗法,虽然在一定程度上可以有效地治疗部分肿瘤,但由于没有特异性,对机体的正常细胞和免疫系统也有较大伤害,并具有药物利用率低、稳定性差和毒副作用大等缺点,因此极大地限制了在肿瘤治疗中的应用。在这种背景下,肿瘤免疫疗法这一崭新思路的提出,极大地改变了恶性肿瘤治疗的状况,因而于2013年被Science期刊列为当年十大科技突破之首,已成为近年来恶性肿瘤临床治疗的一项极具前景的新策略[1]。

免疫治疗是指针对机体低下或亢进的免疫状态,人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病的目的。免疫治疗基于免疫系统保护宿主的功能及其具有的特异性、记忆性,一直被认为是治疗疾病的潜在方法。受上述免疫治疗特征的启发,科研人员正利用该特性,对各式感染疾病、自身免疫疾病、移植排斥反应及肿瘤疾病等开展基础和临床研究。在这些领域中,肿瘤免疫治疗在临床上取得了备受瞩目的成果。

2 纳米载体与肿瘤免疫治疗

正常情况下,免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞。但为了生存和繁殖,肿瘤细胞能够采用不同策略,抑制人体免疫系统,使其不能正常地识别并杀伤肿瘤细胞,从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存,肿瘤细胞的上述特征被称为免疫逃逸。为了更好地理解肿瘤免疫的多环节、多步骤之间的联系,研究人员提出了肿瘤-免疫循环的概念[2],主要有以下七个环节:(1)肿瘤抗原释放;(2)肿瘤抗原呈递;(3)启动和激活效应性T细胞;(4)T细胞向肿瘤组织迁移;(5)肿瘤组织T细胞浸润;(6)T细胞识别肿瘤细胞;(7)清除肿瘤细胞。其中任一环节出现异常均可能导致抗肿瘤-免疫循环失效,出现肿瘤的免疫逃逸。不同肿瘤可以诱导不同环节的异常来抑制免疫系统对肿瘤细胞的有效识别和杀伤,从而产生免疫耐受,甚至促进肿瘤的生长与扩散转移[3,4]。

肿瘤免疫治疗是一种通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环,恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应,从而控制并清除肿瘤细胞的治疗方法[5]。其治疗原理是揭露肿瘤细胞的欺骗手段,激活免疫系统,靶向识别并攻击肿瘤细胞,同时提醒免疫系统清除血液循环中的扩散性肿瘤细胞并遏制其向远处器官的微转移[6]。肿瘤免疫疗法与传统治疗方法的关键区别在于,其靶标是机体自身的免疫系统,而并非肿瘤本身。

在肿瘤免疫治疗中,需要载体系统携载免疫调节药物进入体内,靶向递送至药物目标区域,调节免疫机能,而纳米载体即可满足该需求。纳米载体是指具有纳米尺度(1~1000 nm)的载体,是一种属于纳米级范畴的物质载体输送系统,可以实现对多种药物分子、免疫佐剂或者相关抗原抗体等免疫调节物质的携载,并进行靶向递送。纳米载体本身特殊的尺度特性和理化性质,使其能够通过高通透性和滞留效应(EPR效应)来协助药物穿过体内各种屏障,达到在肿瘤部位富集的效果;通过纳米载体表面的抗体或药物修饰,可以提高药物靶向性,有效改善药物分布;通过更高效地递送免疫调节物质,调节免疫反应强度,而实现对肿瘤生长的有效抑制。因此,为了进一步优化肿瘤免疫治疗的效果,将纳米载体应用于肿瘤免疫治疗领域已经成为新兴的研究热点。

3 细胞膜修饰纳米载体及其作用机制

尽管纳米载体已成为肿瘤免疫治疗的关键一环,但其在生物体内的应用仍面临着免疫清除等风险。免疫系统是生物体内最有力的防御武器,它能够识别细菌、病毒、微生物等外源入侵物,并对其进行免疫清除,确保机体平稳运转。然而,在免疫系统顺利解除外源入侵威胁的同时,参与体内药物运输的纳米载体同样会受到免疫系统的干预,导致药物运输障碍。血浆蛋白在纳米颗粒表面的吸附就是免疫系统自我防御的第一道屏障,它可以导致纳米颗粒表面性质发生各种变化,如聚集和电荷中和、防御级联反应的生化激活,并触发吞噬细胞等多种免疫细胞对其进行清除[7]。因此,如何帮助纳米载体逃脱机体的免疫清除,延长在生物内的循环时间,已成科研人员的一大研究热点[8]。

过去常常用于提高纳米载体内循环时间的策略是“躲避”,例如在纳米颗粒表面修饰PEG,通过PEG酰化在纳米颗粒表面形成一层柔性聚合物涂层,利用PEG分子链的空间形态在其周围产生刷状边界,形成亲水屏障,并提供空间位阻阻断受体相互作用,减少蛋白质吸附和抗体结合,进而躲避免疫细胞的清除[7,9]。然而在临床研究中发现:PEG酰化修饰的纳米颗粒重复应用时会在体内产生抗体,引发抗PEG免疫反应,诱发更快速的血液清除;随着使用次数的增加,纳米载体的药效会变差,循环时间变短[10⇓~12]。为了解决该问题,一种新的策略——“伪装”,逐渐步入人们的视野。加州大学圣地亚哥分校的张良方等率先提出“伪装”策略,即将红细胞与免疫细胞之间存在的识别、对话机制通过细胞膜修饰移用到纳米材料中,以此获得伪装来逃避免疫细胞对纳米载体的清除,由此衍生出细胞膜修饰的纳米载体仿生递送平台[13]。

在当前的研究中,利用细胞膜来修饰纳米载体主要分为三个步骤,包括细胞膜的提取、纳米颗粒“核”的制备,以及将二者融合成核-壳结构纳米载体。细胞膜的提取主要是先通过低渗溶解破坏细胞,离心分离出细胞内部的物质,获得细胞膜片段,进而利用超声和机械挤压相结合的形式通过多孔膜令细胞膜形成囊泡,随后与纳米颗粒共挤出形成细胞膜包覆纳米颗粒[14]。

由于生物细胞膜固有的电荷不对称性,已经证明带负电荷的纳米颗粒表面最有利于膜的包覆,对膜结构和流动性的破坏性较小;而带正电荷的纳米颗粒会与带负电荷的细胞膜产生强烈的静电相互作用,形成尺寸较大的多分散聚集体。同时,研究人员发现,带有负电荷的纳米颗粒表面和带有不对称电荷的细胞膜之间的静电斥力也提供了一种驱动力,有利于细胞膜的表面向外取向,使得大部分膜蛋白、表面聚糖等都处于朝外的状态。细胞膜上大量的亲水性表面聚糖也为细胞膜包覆纳米颗粒提供了良好的稳定作用,具有较高表面能的非稳定聚合物表面容易与聚糖稳定的膜相互作用,从而使整体能量最小化,而聚糖稳定的膜表面则阻止了进一步的膜相互作用[15,16]。

对于细胞膜包覆纳米颗粒的途径而言,为使通过离心分离和低渗处理得到的细胞膜与纳米颗粒核心高效地融合在一起,并避免药物渗漏和蛋白质变性,膜挤压和超声处理是最常用的两种方法。膜挤压法一般是将细胞膜与纳米颗粒混合,通过各种纳米尺寸的聚碳酸酯多孔膜对其进行多次共挤出,以获得细胞膜包覆的纳米载体。尽管该法非常有效,但应用于大规模制备仍具有一定挑战性,因此人们继续探索利用超声处理诱导细胞膜与纳米颗粒的融合,其操作更加简便,同时具有较大的应用价值。此外,近年来还报道了基于微流控电穿孔的方法,以实现对纳米颗粒的完全膜覆盖,与上述几种方法共同构造了细胞膜修饰的纳米载体仿生平台[17]。

该平台不仅包含纳米载体自身的理化性质,还具有类天然细胞的生物性能,将其应用于肿瘤免疫治疗,主要有以下几点作用[18⇓⇓⇓⇓~23]:

(1)细胞膜修饰的纳米载体可以伪装成内源性物质,保留原细胞膜结构的相应功能和表面理化特性,可以躲避免疫学上的识别,如减少网状内皮系统的摄取等,提高抗免疫清除能力,具有更好的血液长循环能力。

(2)通过对细胞膜修饰纳米载体的设计和调控,可以保护药物不被降解,增加药物的稳定性,提升药物体内活性和给药效率,并实现对药物的可控连续缓慢释放,减少治疗药物的使用剂量。

(3)纳米载体可以保持细胞膜良好的生物相容性,具有相对较低的细胞毒性和免疫原性,不会造成显著的副作用和排异反应,降低药物在内脏器官中的聚集和毒副作用。

(4)纳米载体借助细胞膜上的特异性识别单元(蛋白质、多糖、脂类等),获得特定的靶向性和同源靶向能力,有效地提高了在生物体内特定区域的富集量,增强药物靶向运输的效率,改善药物的生物分布。

(5)部分细胞膜修饰的纳米载体系统也能够用于特定肿瘤的成像和防治,实现肿瘤的诊断、预防和治疗一体化。

(6)纳米载体和细胞膜都具有良好的可修饰性,使得该仿生递送体系具备联合载药和共靶向递送等潜能,实现免疫治疗联合化学治疗、光热治疗等多种疗法进行肿瘤治疗。

细胞膜来源的不同使得其在机体内发挥的生物学功能也不尽相同,可根据具体的要求选用相应的细胞膜修饰纳米载体,保持其原有的功能不变,同时转移细胞膜的生物性能,使得纳米载体在原有功能的基础上达到更好的肿瘤免疫治疗效果[24]。

科研人员基于红细胞膜修饰纳米载体的研究上,又开发了一系列基于血小板膜、巨噬细胞膜、干细胞膜、肿瘤细胞膜及细菌膜修饰的纳米载体。这些新型仿生纳米载体在功能上更为多样化,兼具血液内长循环和药物负载的功能,又集成了主动靶向、免疫抗原、可控缓释等特性,提升了纳米载体在肿瘤诊断与治疗中的应用潜能[8]。

4 细胞膜修饰纳米载体在肿瘤免疫治疗中的应用

细胞作为一种最基本的生命活动单元,具有人体所需的各种重要功能,而且每一种细胞都有其独特之处。细胞膜则是生物体内信息交换、信号传达的重要媒介,其表面丰富的识别单元(如蛋白质、糖类等)赋予其高度生物特异性。在肿瘤免疫治疗领域,利用各种细胞膜修饰纳米载体携载免疫调节药物的研究中,不少已取得一定成效,下面对包括红细胞膜、血小板膜、免疫细胞膜、肿瘤细胞膜等多种细胞膜修饰的纳米载体及其在肿瘤免疫治疗中的相应作用逐一介绍。

4.1 红细胞膜修饰纳米载体

红细胞(RBC)是血液中最常见的细胞,在体内主要负责输送氧气,能够随血液流动遍布全身,其最大特点为长循环能力,并且由于具有良好的生物相容性、弹性可塑性和非免疫原性以及资源丰富易获得等优点,是较早被用于药物载体表面修饰的细胞。红细胞膜表面保留的CD58和CD59蛋白是CD2蛋白的相应配体,CD2广泛存在于T淋巴细胞表面,是免疫球蛋白超家族的成员,在细胞-细胞黏附中起着关键作用,CD58和CD59也被认为在T细胞与靶细胞的相互作用中起着重要作用[25]。另外,红细胞表面含有大量的自识别标记如蛋白质、糖类和唾液酸基团等物质,可以有效抑制免疫攻击[26]。从红细胞中分离得到的红细胞膜能够更好地保护被运载物质的活性,使其具有更长和更可控的生命周期,避免免疫系统的清除。通过继承红细胞的长循环能力等优点,红细胞膜修饰的纳米载体成为极具价值的一种运输载体[27]。

为了提高树突状细胞(DC)靶向性和抗原提呈效率,Guo等[28]开发了红细胞膜包裹的聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)纳米颗粒,用于携载hgp10025-33抗原肽和Toll样受体4激动剂单磷酰脂质A(MPLA)。通过构建嵌入甘露糖的膜结构以主动靶向淋巴器官中的抗原递呈细胞(APC),并最终制备了易于在细胞内环境中裂解的氧化还原敏感肽结合的PLGA纳米颗粒(图1)。该纳米疫苗具备红细胞膜保留的特异性蛋白质——如CD47,其能够与主要在巨噬细胞等免疫细胞表面表达的受体SIRPα结合,相互作用诱导产生“别吃我”的抑制信号,抑制巨噬细胞的吞噬活性,从而避免被吞噬清除,延长体内循环时间[29];而在细胞膜上插入的甘露糖结构则具有靶向淋巴细胞表面甘露糖受体的能力,体外实验发现其可以增强淋巴细胞摄取,并在给药部位实现抗原聚集效应,促进其在引流淋巴结的滞留;此疫苗还可以有效增强干扰素IFN-γ的分泌和CD8+ T细胞的应答,经其诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)含量可达到36.6%,显著高于单纯注射游离肽+MPLA(hgp+M)的27.6%和PLGA-NPhgp+M的28.4%。该实验结果显示了将红细胞膜包裹的聚合物纳米载体应用于肿瘤免疫治疗中抗原传递中的优越性。

基底样乳腺癌呈三阴性表型,即使采用传统的化学治疗和抗人表皮生长因子受体(HER)治疗,预后效果也很不理想。但是,免疫治疗却非常适合这种高突变率的顽固性肿瘤。Liang等[30]研发了一种仿生黑磷量子点(BPQDs)纳米制剂,通过近红外(NIR)激光辐照原位诱导乳腺癌细胞凋亡,以调动免疫系统消除残留和转移性肿瘤细胞。使用红细胞膜(RM)覆盖BPQD,形成BPQD-RM纳米囊泡仿生制剂(BPQD-RMNV),该制剂能够在体内表现出更长的循环时间和更好的肿瘤富集性。基底样4T1乳腺肿瘤在NIR激光照射下发生凋亡和坏死,并募集树突状细胞(DC)以在体内捕获肿瘤抗原。此外,在该纳米囊泡中采用程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体(αPD-1)可以防止CD8+ T细胞衰竭。总之,BPQD-RMNV介导的光热治疗(PTT)联合免疫检查点阻断抗体可增强CD8+ T细胞在肿瘤中的浸润和活性,直接抑制基底样乳腺肿瘤的生长。

具有肿瘤微环境响应特性的仿生纳米凝胶还可用于化学疗法和免疫疗法联合的抗肿瘤协同治疗。Song等[31]以羟丙基β-环糊精丙烯酸酯和两种反电荷壳聚糖衍生物制备纳米凝胶,用于包埋抗癌药物紫杉醇并精确控制纳米凝胶的pH响应性。再用红细胞膜修饰该纳米凝胶,可在不降低生物活性的情况下,实现免疫治疗剂白介素-2的递送。该纳米凝胶通过在肿瘤微环境中响应性释放药物,显著提高了药物渗透性和抗肿瘤活性,并诱导了钙网蛋白的暴露,增强抗肿瘤免疫。通过低剂量联合用药可改善肿瘤微环境,增强免疫效应细胞浸润,减少免疫抑制因子。

当前已设计出多功能治疗性纳米载体系统来弥补肿瘤单一疗法的不足,包括利用免疫疗法来刺激宿主免疫系统以根除癌症,并利用纳米系统中的光活化成分以组合形式提供额外的光疗效果,从而通过最小化脱靶效应和肿瘤诱导的免疫抑制来提高抗肿瘤效果。但是,由于系统毒性和热毒性以及纳米载体组分难以代谢等问题,阻碍了联合疗法的实际应用。因此,仍需要设计更强大的多功能纳米载体来增强靶向性,提供持久温和的联合治疗且无明显副作用,进而达成肿瘤的有效治疗。

Ou等[32]开发了一种由基底内核(聚L-组氨酸[H]-接枝黑磷[BP])和表面外壳(红细胞膜[EM])构成的纳米载体,以提供具有红细胞膜伪装的轻度光响应(近红外)活性。再将Ephrin-A2受体特异性肽(YSA,靶向癌细胞)、白细胞介素-1α沉默小干扰RNA(ILsi,限制调节性T细胞转运)和紫杉醇(X,诱导持久性化疗)整合到基底核-壳结构中,形成BP-H-ILs结构,为肿瘤联合治疗提供了一个更智能的纳米载体。红细胞膜的仿生功能化赋予纳米载体逃避巨噬细胞摄取和延长血液循环的能力,从而确保其在肿瘤部位的有效积聚,进一步加强肿瘤联合治疗效果[33]。

4.2 血小板膜修饰纳米载体

血小板与红细胞一样,是哺乳动物血液的重要组成部分,负责止血愈合和免疫反应,还可以黏附在许多疾病相关的基质上[34]。由于血小板上广泛存在相关抗原和功能蛋白,其与免疫防御和靶向受损血管系统相关,同时也能对侵袭性微生物做出反应,因此在抗肿瘤转移中发挥着重要作用[35]。血小板膜表面修饰和红细胞膜表面修饰一样具有延长纳米载体血液循环时间和逃避免疫清除的能力[36];并且由于膜上p-选择素等特异性靶向识别蛋白的存在,血小板膜修饰的纳米载体能显著地被肿瘤细胞(而非正常的成纤维细胞)摄取,具有主动靶向能力,进而增加药物在肿瘤处的富集效率[37]。基于上述优异的性能,血小板膜修饰的纳米载体已经被设计和制造用于多种生物医学应用,其中在肿瘤免疫治疗中同样具有显著疗效。

为了保护纳米颗粒逃避巨噬细胞等免疫细胞的吞噬,靶向输送药物到特定肿瘤部位,张良方等[18]开发了基于血小板膜的仿生纳米递送系统(PNP-Dtxl),用血小板细胞膜包裹100 nm尺寸的PLGA纳米颗粒,并携载抗癌药物多西紫杉醇。该仿生纳米颗粒完整地保留了血小板膜的生物学功能,膜上存在的整合素相关蛋白CD47蛋白可以向免疫细胞发出伪装信号,逃避免疫攻击;并能够通过血小板的靶向作用聚集在肿瘤区域,对肿瘤细胞进行杀伤,调节肿瘤相关微环境,免疫抑制肿瘤生长。为了证明PNP可以利用血小板膜固有的靶向黏附机制来递送药物,他们将一种能表达血小板黏附素的金黄色葡萄球菌(MRSA252)作为研究模型,经过实验对比发现,与纯NP相比,PNP的黏附保留率增加了12倍;而且与红细胞膜包覆的纳米颗粒(RBCNP)相比,其保留率比PNP低5倍以上,由此可见,这种黏附机制是膜特异性的。此外,从对血管的影响来看,游离多西紫杉醇造成的血管内膜与中膜的比率(I/M)为0.76±0.18,管腔闭塞率为33.6%,而PNP-Dtxl分别产生了较低的值0.18±0.06和8.0%,这些结果证明了PNP定向给药在改善药物定位于病变血管中的益处。

循环肿瘤细胞(CTCs)是通过血源性传播导致肿瘤向远处器官转移的主要原因,而肿瘤转移导致了超过90%的癌症相关死亡率[38]。过去的基础研究表明,循环中和CTCs可能是预防肿瘤转移的有效策略。CTCs进行的血液循环缺乏与实体肿瘤相同的肿瘤微环境,而是一种通过将不同类型的肿瘤细胞引入血液循环中而产生的独特“微环境”,其中被激活的血小板和纤维蛋白在生理上与血液中的肿瘤细胞有相关作用[39]。受此影响,Li等[40]将生物相容性二氧化硅纳米颗粒与活化血小板膜源性囊泡进行功能化结合修饰,保留了血小板膜上与CTC靶向相关的膜蛋白和聚糖的完整组成,以及参与宿主细胞自我识别的CD47蛋白等物质,以达到靶向CTC和逃避吞噬细胞介导的吞噬作用的目的。此外,将主要的肿瘤杀伤细胞因子——肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)与血小板膜包裹的纳米颗粒结合,诱使TRAIL在肿瘤杀伤性自然杀伤细胞、活化中性粒细胞和细胞毒性T细胞表面高度表达[41]。该仿生纳米载体利用CTC与活化血小板的黏附作用和免疫细胞的肿瘤杀伤活性,产生靶向治疗效果;动物实验表明,在小鼠乳腺癌转移模型中,将该仿生纳米颗粒植入CTC相关的肺血管微血栓中,能够显著减少肺转移。

4.3 免疫细胞膜修饰纳米载体

尽管红细胞膜和血小板膜修饰的纳米载体在逃避网状内皮系统(RES)介导的摄取和免疫识别监测方面显示出优异的性能,但利用其他类型的细胞膜对纳米载体进行表面修饰,仍具有特定的生物功能性和应用。基于此,研究人员注意到了具有免疫功能的白细胞,例如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞和T细胞等,白细胞(免疫细胞)是抵抗病原体入侵的先天免疫系统的重要组成部分。

免疫细胞的细胞膜构造更为复杂,含有其他细胞膜所没有的多种特异性蛋白和糖类,它们能够发起主动的免疫反应以消除炎症、抑制肿瘤的发生。肿瘤组织从本质上讲也属于炎症部位,故诸如巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞都能靶向并在肿瘤部位富集。例如循环肿瘤细胞(CTC)可诱导表达细胞黏附分子(ICAM-1),从而促进CTC黏附和募集到宿主器官,而在中性粒细胞膜表面高度表达的Mac-1分子(CD11b,αMβ2)能够响应此类炎症信号,所以中性粒细胞Mac-1与CTC-ICAM-1的相互作用是一个有吸引力的靶点[42,43]。因此,利用上述含有特异性蛋白的免疫细胞膜构建仿生纳米载体的策略在肿瘤免疫治疗中具有独特的价值[44⇓~46]。

巨噬细胞作为生物体内的第一道防线,一旦检测到感染或组织损伤的信号,会立即被激活并募集、吞噬和消化有害的入侵者。基于这些独特特征,巨噬细胞膜非常适合用于包覆纳米颗粒,以构建用于生物医学应用的仿生载体系统。纳米载体通过借助巨噬细胞膜上的特异性识别蛋白,能够有效提高其在机体内特定部位的聚集,增强药物靶向运输的效率[47⇓~49]。

目前基于高通透性和滞留效应(EPR效应)的纳米药物用于肿瘤治疗往往仍不足以满足靶向的目标,为了克服纳米载体给药的缺点,Liu等[50]报道了一种巨噬细胞膜包覆的激光响应形状可变纳米药物I-P@NPs@M,其表面覆盖的巨噬细胞膜促进了纳米药物的长循环性和肿瘤靶向性。而I-P@NPs@M中的二氢卟吩e6(光敏剂Ce6)能将650 nm激光转化为活性氧(ROS),使球形纳米胶束转变为线形纳米纤维,在肿瘤区域有很强的滞留性,能够长期定位并持续释放药物。ROS通过光动力疗法刺激二聚紫杉醇(PTX)生成单体PTX共同杀伤肿瘤细胞,并诱导免疫原性细胞死亡,与吲哚莫德(IND)协同抑制吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)产生途径,激活免疫应答。通过化疗、光动力疗法和免疫治疗的联合应用,I-P@NPs@M展示出良好的抗肿瘤效果,对肺转移也有明显的抑制作用。

中性粒细胞是最丰富的一种白细胞,在由病原体引起的急性炎症中起着核心作用,并能通过细胞表面黏附分子表达的改变,对循环肿瘤细胞(CTC)和肿瘤转移部位具有天然靶向作用[51]。活化的中性粒细胞可以利用其细胞膜功能来追踪伤口或炎症产生的细胞因子和趋化因子,并积聚发挥抗炎作用[52⇓~54]。同时,实验结果已证明中性粒细胞膜结合蛋白混合物可用于捕获体内循环的肿瘤细胞。中性粒细胞膜包覆的PLGA纳米颗粒有效地提高了对CTC的捕获效率,促使肿瘤回归到转移前的状态,并抑制已经形成的转移性病变[42]。利用这种趋化捕获行为,可以通过将活化中性粒细胞膜包覆在纳米颗粒上构筑仿生纳米系统,从而在药物输送系统中显示出巨大的潜力。

在肿瘤微环境中,中性粒细胞可以通过细胞间黏附分子与肿瘤转移环境和CTC相互作用[55]。基于这一发现,研究人员制备了中性粒细胞膜衍生的纳米囊泡,并在纳米囊泡中装载了含有卡非佐米CFZ(第二代蛋白酶体抑制剂)的聚合物纳米粒(NM-NP-CFZ),以增强对CTC和肿瘤脉管系统的靶向性和消除能力(图2)。这项研究表明,NM-NP可以与CTC结合并在体外定位于转移前内皮细胞,在体内转移前环境中具有良好的靶向性和聚集性。在考虑静态、流态、温度等因素下实验证明了NM-NP在小鼠乳腺癌细胞(4T1细胞)上的靶向黏附效率比纯NP和PLGA-PEG-NP高了2~4倍;而NM-NP-CFZ对于4T1细胞的治疗杀伤数量(23.0%±3.2%)也显著高于NP-CFZ和游离CFZ治疗的细胞(分别为1.88%±0.30%和1.58%±0.27%);且经NM-NP-CFZ处理后,白细胞存活率为94.6%,说明NM-NP-CFZ对白细胞的毒性大大降低。此外,目前的肿瘤治疗(如放射治疗和光动力治疗[PDT])都能够自发地引起免疫反应,激活中性粒细胞浸润肿瘤。由此可见,中性粒细胞膜包裹的聚合物纳米粒是一种强有力的肿瘤免疫治疗途径,能够通过多种不同机制防止肿瘤转移[42]。

淋巴细胞也可运载药物,与其他细胞相比,免疫T淋巴细胞具有特异的肿瘤免疫识别能力。T细胞膜上的免疫识别蛋白,如T细胞抗原受体(TCR),可以选择性识别肿瘤表面抗原并激活T细胞,进而展现出对肿瘤的高亲合与杀伤能力。考虑到T细胞的肿瘤特异识别与免疫学功能,T细胞膜修饰的纳米载体将是肿瘤靶向药物递送的优良载体系统[56]。

为了将纳米级药物递送系统的优势与CAR-T细胞的靶向能力结合到一起,Ma等[57]基于细胞膜包覆纳米颗粒和细胞膜靶向修饰技术,将能够特异性识别肝癌细胞表面GPC3蛋白的CAR-T细胞膜涂覆在负载IR780的介孔二氧化硅纳米颗粒上,制备出一种新型纳米材料。通过体外和体内实验,验证了CAR-T细胞膜包裹纳米颗粒与仅负载IR780的介孔二氧化硅纳米颗粒相比,前者具有更优越的靶向性和更小的系统毒性,在肿瘤光热免疫治疗中能发挥更大的作用。

受到肿瘤细胞的高突变性和免疫微环境变化的影响,肿瘤免疫逃逸现象难以杜绝,而双重靶向策略可以为提高纳米载体的肿瘤靶向治疗效应提供一种更为可靠、有效的方法。研究人员利用生物正交技术在肿瘤部位构建人工靶点——BCN基团(双环[6.1.0]壬炔),同时采用糖代谢技术将叠氮基团(N3)嵌入T细胞膜中,然后将提取的N3功能化T细胞膜包裹在负载吲哚菁绿(ICG)的聚合物纳米核心表面,构建了仿生纳米颗粒(N3-TINPs)。T细胞膜上的特殊蛋白(T细胞抗原受体,TCR)赋予了N3-TINPs的肿瘤细胞免疫识别能力,而功能化的N3基团能够与肿瘤细胞上糖代谢标记的人工靶点BCN基团发生高效、特异的生物正交反应。N3-TINPs利用人造靶向和天然靶点双导向治疗技术,极大程度地增强ICG在肿瘤部位的富集,有效克服肿瘤“脱靶效应”,从而提高纳米载体的肿瘤靶向与免疫调节药物的抗肿瘤疗效[56]。

传统的肿瘤治疗,包括手术切除、放疗和化疗等,面临的主要挑战是如何诱导肿瘤细胞死亡,同时充分利用宿主免疫系统达到抗肿瘤效果。为了克服该肿瘤治疗的难题,Yu等[58]开发了一种骨髓源性抑制细胞(MDSC)膜包裹的氧化铁磁性纳米颗粒(MNP@MDSC),可以有效提高纳米颗粒的免疫逃逸、磁共振成像和光热疗法(PTT)诱导的肿瘤杀伤作用,尤其在MDSC膜主动靶向肿瘤方面显示出优越的性能。靶向肿瘤微环境后,MNPs@MDSC可以进行光热疗法和免疫疗法的联合治疗,通过诱导免疫原性细胞死亡,重新编程肿瘤浸润巨噬细胞,降低肿瘤的代谢活性,增强抗肿瘤免疫反应。

4.4 肿瘤细胞膜修饰纳米载体

使用肿瘤细胞膜修饰纳米载体进行肿瘤治疗也吸引了诸多研究人员的关注。肿瘤细胞具有多种独特的功能,包括强大的复制潜能、对细胞死亡的抵抗力、免疫逃逸能力、长循环时间和同源结合能力等,这些特性使它们成为设计抗肿瘤治疗系统的新型修饰材料[59]。所以,肿瘤细胞膜表面相关的多样性抗原和特定的功能蛋白也非常重要,在构建抗肿瘤疫苗时必须考虑这些因素[60]。在肿瘤细胞膜上存在着特异的同源结合黏附分子,如N-钙黏蛋白、半乳糖凝集素-3、上皮细胞黏附分子(EpCAM)等,使其具有与相同膜蛋白的肿瘤细胞之间特异性同源结合的能力,可用于纳米颗粒的表面功能化,以提供同源靶向性[61]。肿瘤细胞膜修饰的纳米载体不仅代表了一种引入膜结合抗原的有效方法,促进肿瘤特异性免疫反应和靶向聚集过程;还代表了一种新的药物输送方法,展示了肿瘤治疗从单纯药物传递到载体免疫治疗的前景。另外,肿瘤细胞膜修饰还可能是开发针对不同类型肿瘤特异性纳米疫苗的新型个性化策略[62]。

仿生纳米颗粒(BNPs)结合了合成材料和生物材料的高度灵活性与功能性,可用于药物输送和免疫调节。研究人员开发并表征了聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA纳米粒与肿瘤细胞膜组分CCMFs(由U87胶质瘤细胞和人乳腺癌细胞构成)结合成的CCMF修饰PLGA纳米颗粒(CCMF-PLGA NPs)(图3)。在对小鼠进行免疫治疗后,近红外荧光成像证实了CCMF-PLGA NPs向近端引流淋巴结(LNs)的迁移,并在小鼠脾脏和淋巴结中观察到更高比例的CD8+ 和CD4+ 细胞毒性T淋巴细胞群。实验表征结果证明,CCMF-PLGA NPs存在完整的膜相关蛋白,包括CXCR4和CD44,具有破坏肿瘤细胞和间质细胞相互作用并启动免疫系统诱导免疫反应的能力,抑制肿瘤细胞向人乳腺成纤维细胞的迁移,而且可使U87细胞的迁移率减少约30%[63,64]。

急性髓细胞性白血病(AML)是成人中最常见的急性白血病,又称血癌。当前AML疗法中的一个障碍是如何在“缓解-复发”期间靶向最小残留癌细胞。关于癌细胞抗原呈递和免疫抑制方面的最新研究表明,肿瘤免疫疗法有望激活针对残留靶标癌细胞的免疫反应。鉴于此,Johnson等[65]开发和表征了一种AML细胞膜包裹的纳米颗粒(AMCNP),携带与用作抗癌疫苗的源白血病细胞相同的表面抗原。通过对C1498小鼠AML细胞膜进行修饰,实现膜结合卵清蛋白(C1498-mOVA)作为模型抗原,用C1498-mOVA膜包覆纳米颗粒,并携载CpG寡核苷酸一起作为免疫刺激佐剂,最终形成具有核-壳结构的C1498-mOVA-AMCNPs。该纳米颗粒保留了AML特异性抗原,在体内接种后有效地刺激了DC-OVA-MHC Ⅰ类交叉表达,诱导增强的抗原特异性免疫反应,提高了对AML的免疫应答。

脂质体在临床上用作肿瘤治疗的药物载体,但容易产生不必要的渗漏和肿瘤靶向性差的问题,可能对健康细胞产生毒副作用,导致肿瘤治疗失败。为了克服这些局限性,Kim等[66]使用光敏剂(KillerRed毒杀红蛋白,KR)-嵌入癌细胞膜(CCM)对脂质体进行功能化,并嵌入一种脂质佐剂,以促进抗肿瘤免疫反应。实验结果发现,KR蛋白能够在CCM上表达,没有从脂质复合体中泄漏,并且由于CCM对源癌细胞具有同型亲合性,脂质体在体内的肿瘤靶向效率大幅提高。该仿生脂质体在光动力治疗中产生细胞毒性活性氧,能有效地诱导肿瘤免疫反应,抑制荷瘤小鼠的原发性肿瘤生长和肺转移。

近年来,肿瘤疫苗一直是肿瘤免疫治疗领域的热点之一。Yang等[67]提出了一种通过用甘露糖修饰的肿瘤细胞膜封装免疫佐剂纳米颗粒来构建肿瘤疫苗的策略。首先用PLGA纳米颗粒加载Toll样受体7激动剂咪喹莫特(R837);然后将该佐剂纳米颗粒(NP-R)涂覆上肿瘤细胞膜(NP-R@M),其表面蛋白可作为肿瘤特异性抗原;最后进一步修饰甘露糖部分,获得的纳米疫苗(NP-R@M-M)可被抗原递呈细胞(如树突状细胞)大量摄取,并可将其刺激至成熟状态以触发抗肿瘤免疫反应。实验结果表明,NP-R@M-M纳米疫苗结合免疫检查点封锁疗法进行疫苗接种具有良好的免疫治疗功效,可大大延缓肿瘤的进展。Fontana等[68]通过在玻璃毛细管微流控设备中进行纳米沉淀制备基于免疫佐剂的多孔硅(PSi)纳米疫苗,并利用肿瘤细胞膜作为囊泡包裹结合了模型抗原的PSi聚合物纳米系统。该多级纳米疫苗在广泛的浓度范围内具有生物相容性,在人体细胞中显示出免疫刺激特性,能够促进刺激信号的表达和抗炎性细胞因子的分泌。

在肿瘤疫苗介导的免疫治疗领域,树突状细胞(DC)的有效抗原处理和递呈特性,使其有望成为肿瘤治疗疫苗开发的靶点。Ni等[69]开发了一种多功能的肿瘤细胞膜(CCM)包裹的碳酸钙(CC)纳米颗粒(MC),能够产生用于DC疫苗接种的原位肿瘤相关抗原(TAAs)。低剂量的阿霉素盐酸盐(DOX)可以封装在纳米粒的CC核中以触发免疫原性细胞死亡(ICD);而常用的光敏剂Ce6被装入纳米颗粒的CCM中,最终构建纳米疫苗(MC/DOX/Ce6),其通过活性氧(ROS)的产生可进行有效的光动力治疗(PDT)。深入研究显示,MC/DOX/Ce6治疗能够诱导TAAs群体和DC招募,从而触发后续免疫级联反应,并且招募的DC细胞可以在原位受到刺激,以便进行有效的疫苗接种。

有效的免疫刺激通常需要将佐剂和肿瘤抗原都传递到体内,为了构建一种有效的疫苗制剂传递多种肿瘤抗原和免疫佐剂,并将这些抗原递送至抗原递呈细胞以刺激内源性免疫反应,研究人员报道了一种仿生纳米颗粒抗肿瘤疫苗的制备。该纳米疫苗将B16-F10小鼠黑色素瘤细胞膜作为全系列肿瘤抗原的来源,将其覆盖于PLGA纳米颗粒,与高度免疫刺激佐剂单磷酰脂质A(MPLA)一起运送,可最大限度地发挥肿瘤抗原和免疫佐剂促进抗原提呈和激活下游免疫过程的能力[62,70]。实验证明,该纳米制剂能在体内引起有效的抗肿瘤免疫反应,并且可以加入免疫检查点抑制剂(如程序性细胞死亡-1抗体)等其他免疫调节药物进行协同作用,以更好抑制肿瘤的生长。这种多种治疗方式联合的复合纳米系统,比单纯呈递肿瘤抗原更能克服免疫抑制的肿瘤微环境,从而达到肿瘤免疫治疗的更好效果[71,72]。

与传统的肿瘤细胞裂解免疫策略相比,个体化的肿瘤细胞纳米疫苗具有良好的前景和优势,能诱导更有效持久的抗肿瘤免疫应答。通过利用手术切除的肿瘤可以构造一种结合PD-1检测点阻断抗体的个体化光热疫苗,以防止肿瘤复发和转移。研究人员制备了涂覆有患者肿瘤细胞膜的黑磷量子点纳米囊泡(BPQD-CCNV),并将其装载到含有GM-CSF和脂多糖(LPS)的热敏水凝胶中。皮下注射BPQD-CCNVs后,GM-CSF的持续释放可有效地诱导树突状细胞捕获肿瘤抗原,而近红外光和脂多糖可以刺激DC的扩展和活化,随后DC到达淋巴结并向CD8+ T细胞呈递抗原。此外,与PD-1抗体联合应用可显著强化肿瘤特异性CD8+ T细胞,清除术后残余及肺转移肿瘤[73,74]。Ochyl等[75]也试图开发一种简单有效的方法,采用自体全肿瘤细胞裂解物进行治疗性疫苗接种,用肿瘤细胞中提取的内源性细胞膜修饰形成聚乙二醇化纳米囊泡(PEG-NPs)。PEG-NPs在体外表现出良好的血清稳定性,在体内皮下给药时对局部淋巴结有良好的引流效果,能诱导更强大的抗原特异性细胞毒性CD8+ T淋巴细胞应答。更重要的是,与抗程序性死亡-1(αPD-1)IgG免疫疗法相结合,PEG-NP疫苗诱导的抗原特异性T细胞反应频率更高,可保护幸存细胞免受肿瘤细胞再攻击。

为了实现各种治疗方法的优势互补与功能放大,现在还有许多关于免疫治疗与化学治疗、光热治疗等其他治疗方法相结合的研究。Wang等[76]将免疫原性纳米颗粒介导的光动力疗法(PDT)与磁热疗法联合应用,协同增强免疫治疗的抗转移疗效。设计的Janus纳米子弹集成了负载光敏剂(Ce6)的二硫桥联磁性头介孔有机二氧化硅体(M-MONs@Ce6),可用于氧化还原/pH引发的光敏剂释放及其基质降解。肿瘤细胞膜的包覆使M-MONs@Ce6具有良好的肿瘤靶向性和更长的血液循环时间。PDT与磁热疗联合应用具有很强的协同抗肿瘤效果,同时引起一系列免疫原性细胞死亡,产生协同的肿瘤特异性免疫反应。当与抗CTLA-4抗体结合时,该仿生纳米系统能够显著根除原发性和深度转移性肿瘤,且系统毒性较低,从而有可能促进磁热疗法、光动力疗法和免疫检查点阻断疗法的联合治疗以对抗肿瘤转移的发展。

尽管在光动力疗法(PDT)中已记录了免疫原性细胞死亡(ICD)和抗原交叉呈递(AC)的效果,但总体免疫功效还是相当有限。为了实现光动力免疫联合疗法,Wang等[77]通过驱动卵清蛋白分子间的二硫键网络,实现了卵清蛋白抗原(OVA)的纳米组装,随后负载光敏剂Ce6的OVA纳米粒子(ON)被B16-OVA肿瘤细胞膜包裹,形成膜包覆ON(MON)。激光照射产生的ROS显著增强了OVA抗原的交叉递呈效率,同时,由于肿瘤细胞膜的覆盖,MON具有对肿瘤的同源靶向性。在治疗B16-OVA荷瘤小鼠时,MON能有效地触发免疫级联反应,在激光照射下完全消除肿瘤,并激发长期抗肿瘤免疫记忆效应。该抗原纳米载体的设计有望通过增强免疫级联来有效提升传统光动力疗法的效果。

为提高抗PD-1免疫疗法应用于黑色素瘤治疗的疗效,Xie等[78]提出一种结合免疫疗法和“饥饿疗法”的治疗方法,以达到更好的抗肿瘤效果。通过在介孔二氧化硅纳米粒(MSN)上加载葡萄糖氧化酶([GOx],可将细胞内的葡萄糖催化转化为葡萄糖酸和H2O2,通过阻断营养供应来抑制肿瘤的生长),并用黑色素肿瘤细胞膜对其进行表面修饰,构造了仿生纳米系统CMSN-GOx(图4)。通过功能化MSN的仿生表面,合成了能够逃离宿主免疫系统监控的纳米颗粒,并提高其肿瘤靶向性和在肿瘤组织中的富集,能够清除肿瘤并诱导树突状细胞成熟,进而刺激抗肿瘤免疫反应。经CMSN-GOx结合PD-1联合治疗后,观察发现CD80和CD86共刺激分子(被广泛用作DC成熟的生物标志物)的百分比从21.48%增加到54.70%,DCs成熟结果表明该治疗方案可产生较强的免疫应答,显示了其改善免疫治疗效果的潜力,综合来看该联合疗法比单独使用“饥饿疗法”或免疫疗法具有更好的抗肿瘤治疗效果。

除单一药物外,肿瘤细胞膜修饰的纳米载体还可以封装具有协同作用的多种药物,确保将多种药物共同运送到肿瘤部位内的相同细胞,以提高协同抗肿瘤效果。Chen等[79]开发了肿瘤细胞膜包覆的纳米颗粒(CCNPs)来联合负载DOX和针对PD-L1的小干扰RNA(siRNA)。DOX可以直接利用CCNP靶向肿瘤细胞进行杀伤,PD-L1则在肿瘤部位过表达,其抑制作用可以降低肿瘤细胞活力并导致抗肿瘤免疫反应增强。在实验中,两种药物可同时负载入PLGA纳米颗粒核中,并通过HeLa宫颈癌细胞膜包裹PLGA-NP来实现高效的同型靶向,实现化疗与免疫疗法的联合治疗。

4.5 细菌膜修饰纳米载体

与基于细胞膜的仿生纳米系统类似,含有特异蛋白的细菌膜也能够与功能性纳米载体相结合,用于药物递送、免疫刺激、延长循环时间和肿瘤成像与治疗等[80⇓~82]。经过多年研究发现,大量细菌已能够通过其配体与特定的哺乳动物细胞和组织形成高度亲合力,一些细菌天然具有由粘附蛋白、抗原或蛋白质外壳表面上的特定分子介导的肿瘤靶向特征。而且,基于细菌能够在厌氧环境中生存的特性,细菌介导的载体系统能够沿循氧气浓度迁移到达体内的缺氧肿瘤[83]。此外,细菌膜表面存在大量的病原体相关分子模式(PAMP),如脂多糖、磷壁酸、肽聚糖、甘露糖、螺旋体脂蛋白、孔蛋白、菌毛和凝集素等,可以诱导天然免疫细胞表面高表达的模式识别受体(PRR)的识别结合,尤其是其中的一系列Toll样受体(TLR),进而激活免疫系统(如DC、APC等免疫细胞),靶向清除肿瘤[84]。例如宿主细胞凝集素能够与细菌膜上的β-葡聚糖和LPS结合;APC表面上的补体受体CR3和p150,95以及相关分子白细胞功能抗原1(LFA-1)等,具有针对细菌膜上不同碳水化合物部分的多个特异性结合位点,其中的C1q能够结合细菌膜上的甘露糖结合凝集素;巨噬细胞和DC表面存在的A型清除剂受体(SR-A),能够识别细菌膜上的脂蛋白、LPS、半乳糖/N-乙酰葡萄糖胺等多种细菌膜成分,进而产生各种靶向效应[85⇓⇓~88]。鉴于上述细菌所具有的卓越性能,有研究者使用从细菌中获取的“特殊细胞膜”——细菌膜,来实现细胞膜修饰纳米载体的策略,这不仅简化了当前基于细菌的药物递送系统,还将这种生物杂交载体缩小为纳米级尺度。与细胞膜修饰的纳米系统相比,细菌膜修饰策略为生物医学应用仿生平台的设计和构建提供了新的思路[8]。

在T细胞识别的众多肿瘤抗原中,随机突变诱导产生的新抗原尤为重要。而在未经肿瘤浸润式淋巴细胞(TILs)浸润的“冷性肿瘤”中,T细胞对肿瘤新抗原的有限识别导致了相应肿瘤免疫反应的缺乏。放射疗法(RT)可以增强对“冷性肿瘤”的免疫识别,从而产生更多样化的抗肿瘤T细胞反应,但是仅经放射疗法难以产生全身性抗肿瘤免疫反应。因此,Patel等[89]开发了一种多功能细菌膜包裹纳米颗粒(BNP),该纳米颗粒由免疫激活的PC7A/CpG多聚体核与细菌膜和酰亚胺基团包裹而成,可以增强抗原递呈效果(图5)。在患有同源黑色素瘤或神经母细胞瘤的小鼠中,使用BNP联合放射疗法和免疫治疗可在放射治疗后捕获肿瘤新抗原,增强其在树突状细胞(DC)中的摄取,并促进其交叉呈递以刺激抗肿瘤T细胞反应。实验测试发现,单独使用BNP治疗和使用BNP+RT治疗的小鼠中分别有87.5%和100%表现出原发性肿瘤完全消退,与单纯RT或无药物对照组小鼠相比,这两组小鼠的转移率显著降低,生存率显著提高。而在抗肿瘤记忆性研究中,使用BNP+RT治疗的小鼠在再激发后表现出75%的肿瘤排斥率,相比之下,单独用BNP治疗的小鼠为50%,而无药物对照组为15%。这些结果表明,BNP+RT联合治疗通过激活DC和效应T细胞,产生了明显的肿瘤消退和特异性抗肿瘤免疫记忆。这种细菌膜包被的纳米载体有助于T细胞原位免疫识别放疗辐射后的肿瘤,从而可以使用现有策略进行新型的个性化肿瘤免疫治疗。

目前,细菌膜修饰纳米载体的研究仍处于优化阶段,尚未达到常规细胞膜修饰过程的多功能性。因此,这个领域的研究工作仍有待进一步开展与深化。

4.6 其他细胞膜修饰纳米载体

除上述几种较为常见的细胞膜修饰纳米载体之外,还有一些特殊的细胞膜或复合膜修饰的纳米载体系统,正被科研人员广泛地探索与研究。

例如,生物体中不可忽视的一类重要细胞——干细胞,其可以分化成各种类型的细胞以产生所需的生物学功能。许多类型的干细胞,比如骨髓间充质干细胞(MSCs)和神经干细胞(NSCs)均被证实具有特异性靶向肿瘤的能力[90]。干细胞能够被肿瘤细胞分泌的趋化因子诱导而向肿瘤区域聚集,其中的分子识别机制较为复杂,目前对其研究较为成熟的靶向识别作用包括基质细胞衍生因子1(SDF1,也称为CXCL12)及其受体CXC趋化因子受体4(CXCR4)、PI3K信号通路、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)-uPA受体(uPAR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和基质金属蛋白酶1(MMP1)-蛋白酶激活受体1(PAR1)等[91⇓~93]。经过修饰的干细胞能够在肿瘤组织区域分泌诸如肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、干扰素-β(IFN-β)、IL-12/18因子等,以抑制肿瘤细胞的增殖[94⇓~96]。间充质干细胞主要通过细胞间表面接触和化学趋化的方式靶向肿瘤细胞,其靶向机理为肿瘤特异性靶向而非物种专一性靶向,可以通过分离不同类型的间充质干细胞靶向不同类型的肿瘤细胞;再加上干细胞的免疫原性较低[97],因此可利用不同间充质干细胞膜对纳米载体进行表面修饰,制备干细胞膜修饰的纳米凝胶颗粒,提高纳米载体在生物体内的抗免疫清除能力、血液长循环能力和肿瘤靶向识别能力[98,99]。

近些年来,研究人员试图通过化学修饰纳米载体的方式,延长纳米载体在血液循环中的寿命。然而,化学修饰纳米载体依然无法完全避免免疫清除反应的发生,仍然存在一定的毒副作用。针对这一问题,Gao等[100]采用自上而下的制备方法,将间充质干细胞膜通过物理挤压的方式修饰在明胶纳米凝胶上,开发了一种高肿瘤靶向性和生物相容性的药物纳米传递系统(SCMGs),其具备天然干细胞膜的生物学功能,具有显著的体内外稳定性。实验结果表明,此体系能够高效地将抗肿瘤药物运输到肿瘤部位,且实现了pH敏感释放,大大增加药物在肿瘤细胞中的积累,从而显著提高了对肿瘤细胞的杀伤作用。将该纳米传递系统负载上免疫调节药物,精准靶向肿瘤部位微环境,将在肿瘤免疫治疗中发挥出更大作用。

为了进一步增强细胞膜修饰的纳米载体的功能性,张良方等[36]突破性地将两种不同细胞膜(红细胞膜和血小板膜)融合在一起并包裹于纳米颗粒表面,这两种细胞膜各自的蛋白标记分子(如红细胞膜上的特征蛋白 CD235a、血小板膜上对其粘附性能有重要作用的 CD41 和 CD61、两种细胞上都表达且能够抗免疫系统巨噬细胞吞噬的 CD44等)都能够保留其上。他们首次构建了同时具有两种细胞膜生物功能的新型融合细胞膜包裹纳米载体,并对其结构和功能进行了详细的表征。研究表明融合细胞膜包裹纳米颗粒在结构上保留了与单一细胞膜包裹的纳米颗粒的相似性,且在各自特定的功能上呈现出完美的结合,兼具良好的生物相容性、抗免疫清除能力、肿瘤靶向性和较长的体内循环时间。

此项研究在现有仿生纳米系统的基础上实现了突破,克服了单一细胞膜修饰纳米载体的功能局限性,验证了不同细胞膜共同包裹纳米颗粒以构建纳米载体的可行性。其潜在的整合能力和进一步增强多种细胞膜功能修饰的可能性为未来根据疾病个性化构建仿生纳米系统提供了行之有效的技术平台,可在药物递送、免疫调节、毒物吸附等诸多领域中获得广泛应用。

随后,Liu等[101]也提出了利用树突状细胞(DC)和肿瘤细胞衍生的融合细胞(FCs)生物重组膜(FM)来修饰肿瘤纳米疫苗的概念(图6)。研究人员将FM修饰的MOF结构纳米颗粒(NP@FM)与单纯纳米颗粒NP、树突状细胞膜包覆的纳米颗粒(NP@DM)、肿瘤细胞膜包覆的纳米颗粒(NP@CM)分别注射入小鼠,后接种4T1肿瘤细胞,实验结果表明NP@FM组无瘤小鼠的比例高达60%,而使用NP@CM预处理的对照组为零,使用NP或NP@DM预处理的对照组为20%。而且为了观察能够促进CTL产生的免疫刺激细胞因子的分泌情况,实验发现NP@FM组CTLs相应比例为14.45%,高于NP组(9.53%)、NP@CM组(9.69%)和NP@DM组(11.02%),可见融合重组膜的功能优越性。这两种免疫相关细胞的融合可在融合膜上高度表达肿瘤抗原复合物和免疫共刺激分子,使得NP@FM能够像抗原递呈细胞(APCs)一样发挥T细胞免疫激活的功能。此外,DC可以生物识别带有肿瘤抗原的NP@FM,从而诱导DC介导的T细胞免疫激活。这两种免疫激活途径的结合提供了强大的抗肿瘤免疫反应,为开发针对多种肿瘤类型的纳米疫苗提供了更多的选择。

对于肿瘤免疫治疗后常产生骨髓源性抑制细胞(MDSCs)介导免疫抑制的问题[102],近期研究表明,MDSCs对多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素等化疗药物敏感,化学治疗可以通过诱导肿瘤细胞死亡而使抗原脱落和递呈,增强宿主对肿瘤的免疫应答[103]。因此,联合化疗与免疫治疗是一种很有前途的协同抗肿瘤策略。Wu等[104]报道了以超分子聚合物DOX /聚乙烯亚胺-改性(2-羟丙基)-γ-环糊精(HPAD)为核心的新型S-CM-HPAD纳米颗粒,该纳米粒被肿瘤细胞膜-乳酸杆菌膜S层蛋白协同修饰,用于联合化学免疫治疗进行有效的恶性肿瘤清除和转移抑制。在S-CM-HPAD NPs纳米载体系统中,包裹的小鼠黑色素瘤B16F10肿瘤细胞膜赋予其同源靶向的能力和肿瘤相关抗原特性;通过负载DOX,不仅可以杀死肿瘤细胞,还可以消除肿瘤诱导的MDSCs,增强抗肿瘤免疫治疗作用;乳酸杆菌膜S层蛋白作为天然佐剂经由自组装修饰在S-CM-HPAD NPs表面,其通过促进T细胞增殖和细胞因子分泌改变肿瘤微环境,保护抗原并激活抗肿瘤免疫反应。该实验结果表明,S层蛋白增强的化学免疫疗法可以为细胞膜修饰纳米载体进行肿瘤治疗提供一种新的策略。

肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是一种颇具研究价值的肿瘤免疫治疗靶标,而使用纳米药物递送系统(NDDS)进行TAM靶向治疗极具挑战性。为了攻克这一技术壁垒,Wang等[105]制备了一种新型红细胞-癌细胞复合膜修饰的pH响应共聚物纳米胶束(右旋糖酐-接枝-聚组氨酸共聚物),负载选择性集落刺激因子1受体(CSF-1R)抑制剂——BLZ-945,共同组成纳米载体系统DH@ECm。DH@ECm具有足够小的粒径(约190 nm)和良好的免疫伪装及肿瘤靶向性,在肿瘤酸性微环境中,DH@ECm还具有pH响应特性和独特的膜逃逸效应,可以通过右旋糖酐-CD206受体特异性相互作用促进TAMs对其的识别和内化,进而释放CSF-1R抑制剂清除TAMs。在体内实验研究中,DH@ECm可改善肿瘤免疫微环境,提升CD8+ T细胞表达水平,具有良好的肿瘤免疫治疗效果。

5 结论与展望

随着对肿瘤发生机制的进一步研究和生物技术的发展,肿瘤治疗手段不断得到完善。越来越多的实验和临床研究表明,肿瘤免疫疗法是一种非常有效的抗肿瘤治疗方法。对于肿瘤免疫治疗仍面临的一系列挑战,纳米载体递送系统在提高抗肿瘤免疫效果和克服免疫抑制等方面展现了重要应用前景,而新型仿生纳米载体在肿瘤免疫治疗中的应用已成为当前研究的重点。

本文系统介绍了细胞膜修饰的仿生纳米载体系统在肿瘤免疫治疗中的研究进展。基于仿生策略,利用细胞膜融合技术和自组装技术,细胞膜的特定功能和生物特性(例如长循环时间、免疫逃逸、抗生物黏附和肿瘤特异性靶向等)被转移到纳米载体中;同时亲代细胞(红细胞、血小板、免疫细胞、肿瘤细胞和细菌等)的多样性为各种肿瘤免疫治疗应用提供了丰富的涂层修饰选择。另外,大多数合成的纳米载体都可使用细胞膜进行表面修饰,从而形成具有生物相容性且无免疫原性的仿生纳米递送系统。

此外,在设计使用细胞膜修饰纳米载体时,必须考虑诸多因素,包括纳米载体的大小、形状、电荷、表面涂层以及抗原和佐剂的结合等,还需要兼顾各种细胞膜的特异性功能,以及抗原或药物修饰纳米载体的问题,以使仿生纳米系统能够精准靶向目标组织,并加强目标组织摄取能力,实现药物的可控连续释放,激活树突状细胞等免疫细胞,改善抑制性肿瘤微环境,发挥出最大的抗肿瘤免疫作用。

在当前研究的基础上,为提高细胞膜修饰纳米载体在肿瘤免疫治疗中的应用,加强肿瘤免疫治疗效果,可以开展或深入以下几个方面的研究:

(1)持续探索新型免疫药物、纳米载体和新型细胞或细菌膜,根据它们各自的特性研究设计最佳的负载搭配和多药物共输运体系,调控细胞膜与纳米颗粒的混合比例以优化融合包覆过程,实现更高的包封效率和良好的控制释放能力。

(2)加强对免疫学及生物学方面的机制理论研究,确定细胞膜中某些特定的功能蛋白和结构单元的未知作用,并尝试对细胞膜表面特异性抗原蛋白进行识别、去除或添加操作,以便于更精确地修饰纳米载体。

(3)加强对肿瘤免疫治疗机制和纳米递送机制的研究,对人体免疫系统和肿瘤微环境细化了解,有利于设计更精确的肿瘤免疫治疗。

(4)探索使用更多混合类型的复合膜组分修饰纳米载体,或将由抗体、DNA/RNA、蛋白质或酶组成的易溶配体掺入细胞膜修饰涂层中进行额外的表面功能化,引入超越单纯细胞膜的多种生物学功能,增强肿瘤免疫治疗应用中的协同性能。

(5)探索利用患者自身细胞制备的细胞膜修饰纳米载体,进行个体化给药和治疗,达到肿瘤精准治疗的效果。

(6)加强免疫疗法与化学疗法、放射疗法、光热疗法等其他治疗方法的广泛结合,将其他疗法直接杀伤肿瘤和免疫疗法刺激免疫系统抗肿瘤的优点有机结合,实现多种肿瘤治疗手段一体化。

总之,基于细胞膜修饰的纳米载体平台在肿瘤诊断和治疗方面的研究尚处于起步阶段,从实验研究到临床应用的转变必须克服许多挑战。随着纳米材料的不断优化以及纳米技术的蓬勃发展,将开发出更具创新性、更高效的基于细胞膜修饰的纳米载体系统,为肿瘤免疫治疗的突破提供平台和机遇。

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