IF=24.5！发顶刊不难！一文get肠道菌群的研究套路

肠道菌群是近几年国自然的热点问题，今年不出意外也会是关注的焦点。虽然是热点问题，但肠道菌群的相关科研思路和实验技术都较为简单，很容易学习和借鉴。

本文介绍的这篇影响因子24.5，刊登在Gut Microbes上的文章：吸烟通过调节肠道微生物和相关代谢物促进结肠直肠癌就是其中的代表。这篇文章很好的将吸烟，肠道菌群，结肠直肠癌联系在了一起，而且科研思路也很经典，值得大家借鉴学习。接下来，就和小瑞一起来学习一下吧~

01背景

结肠直肠癌是全球高发癌症之一，而且有证据表明生活方式与结肠直肠癌的发生存在联系。吸烟是肺癌发生的主要原因，而且吸烟也会导致其他癌症的患病风险提高，比如结肠直肠癌，胰腺癌，肾脏癌等等，但这些器官并没有暴露在烟雾的影响下。有证据表明，吸烟与结直肠癌的发病和死亡率都显著相关。

而且在戒烟后，观察到了人体内细菌多样性的增加。在作者以前的研究中，观察到结肠直肠癌患者体内的肠道微生物可以促进小鼠结肠肿瘤的发生，这说明肠道微生物与结肠肿瘤的发生存在联系。

在作者以前的研究中，已经证明肠道菌群与结肠肿瘤的发生之间存在联系。在这篇研究中，作者通过构建常规和无菌小鼠的动物疾病模型，进一步研究了吸烟对肠道微生物的影响，以及受影响的肠道微生物的代谢产物如何变化，这些代谢产物最终又是通过什么方式，最终影响结肠直肠癌的发生的。

02结果

☑1.吸烟可促进小鼠结肠直肠肿瘤的发生

作者首先用AOM法处理小鼠，构建了小鼠的结肠直肠癌疾病模型。之后将构建的小鼠疾病模型分别暴露在含有香烟的烟雾中和洁净的空气中作对照实验。（图1）

结果发现不论是数量还是大小，暴露在烟雾中的小鼠结肠肿瘤都比对照组小鼠的大而多，且烟雾中结肠肿瘤的发病率显著提升。（图2）

以Ki-67作为增殖性细胞核的标记物，发现暴露在烟雾中小鼠的结肠上皮组织中Ki-67阳性细胞显著增多（图3A），PCNA的表达水平也很高（图3B）。这说明烟雾组小鼠的结肠上皮细胞显著的增多了。

在这一部分中，作者通过“有烟组”和“无烟组”的对照实验，成功将吸烟这种行为和结肠直肠癌联系在了一起，并且通过对Ki-67阳性细胞和PCNA表达水平的鉴定，将吸烟与小鼠结肠上皮细胞的增多相关联，为后面的通路研究做出了铺垫。

☑2.香烟烟雾对小鼠肠道微生物的影响

在这一部分里，作者首先使用16s测序技术对小鼠粪便进行测序，检验笼内参数对肠道微生物组的影响。作者在三个时间点收集粪便样本，并对每一组进行分析。AOM组和AOMS组均被饲养在4个笼子中，每笼3-4只小鼠（n= 15只小鼠）（图4A）。并发现长期吸烟对小鼠的微生物群落影响显著。（图4。图4B为吸烟组和非吸烟组的α值和β值；图4C为在进行任何处理前，吸烟组和非吸烟组的基线微生物群多样性；图4D为处理后28周小鼠肠道微生物的α多样性。）

接着用鸟枪法对小鼠粪便样本的宏基因组进行了测序，Fisher统计和PCoA对测序数据进行了分析，发现在开始时“有烟组”和“无烟组”的微生物组成在多样性方面并没有显著差异。在28周后，有烟组的微生物多样性显著低于无烟组的，PCoA分析则显示烟雾暴露组的微生物聚类也与有烟组显著不同。（图5A、B）

然后对具体的微生物群落进行了分析，发现20种微生物在烟雾暴露组中发生了显著变化，其中迟缓埃格特菌（Eggerthella lenta）丰度显著高于对照，并通过RT-PCR进行了验证。（图6A、B）

接着和已有的临床数据集进行联系，说明了迟缓埃格特菌和人类结肠癌之间的联系。最后，作者还讨论了烟雾暴露组和无烟组小鼠之间不同丰度微生物之间的相互作用的生态网络。（图7）

接下来作者研究了小鼠粪便中微生物的相关代谢物，通过液相色谱法和质谱分析，发现烟雾暴露组小鼠的粪便代谢谱与无烟组小鼠的显著差异。（图8A）有41种代谢物发生了改变。（图8B）

并对这些代谢产物的相关通路进行了富集分析，发现烟雾暴露组小鼠的胆汁酸合成途径显著富集。（图9）

这说明香烟烟雾使小鼠的胆汁酸合成途径受到影响，并发现致癌原TDCA的丰度提高。而TDCA在正常情况下，是在胆汁酸合成途径中由肠道里的细菌将初生胆汁酸吸收后产生的次生胆汁酸。靶向MS也进一步证明了TDCA丰度的增加。（图8B，图10）

之后作者使用Spearman相关性分析法，研究了细菌与代谢物的相关性，发现迟缓埃格特菌和TDCA的正相关最大，两种益生菌L. jensenii和L. crispatus和TDCA呈负相关。（图11）

并且通过对迟缓埃格特菌与次生胆汁酸合成相关基因的表达量检测，进一步证明了TDCA的浓度和迟缓埃格特菌丰度的关系。（图12）

在这一部分里，作者通过16s测序和宏基因组测序，对有烟组和无烟组小鼠的肠道微生物的丰度，组成和相互作用进行了讨论，并和已有的临床数据集进行了联系，说明了吸烟对小鼠肠道菌群的改变以及这些改变和人类结肠癌之间的联系。接着通过液相色谱法和质谱分析，以及代谢产物相关通路的富集分析和基因表达量分析，确定了代谢产物TDCA和迟缓埃格特菌的相关性。

☑3.香烟烟雾对小鼠致癌信号通路，促炎信号基因表达的影响

首先，作者利用 Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array对小鼠结肠上皮细胞的相关致癌基因进行了分析，并对高表达的基因进行了富集。鉴定出了烟雾暴露组小鼠中最活跃的信号通路MAPK（mitogen-activated protein kinases，MARK）。（图13A，B）

作者通过查阅以前的研究，发现TDCA可激活MARK信号通路中的ERK亚家族，并通过烟雾暴露组小鼠结肠上皮细胞中MARK/ERK通路中关键中介蛋白磷酸化水平的提高，证明了香烟烟雾对MARK/ERK信号通路的诱导作用。（图14）

之后，作者利用小鼠自身炎症反应和自身免疫PCR阵列分析了促炎基因的表达，并通过高表达的促炎基因确定了香烟烟雾诱导下改变了的相关通路IL-17（proinflammatory interleukin 17，IL-17）和TNF（tumour necrosis factor，TNF）。（图15A、B）通过RT-PCR进一步分析了相关基因的表达，确定了香烟烟雾促进了结肠肿瘤发生过程中相关的炎症反应。（图15C）

在这一部分中，作者通过Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array对小鼠相关的致癌信号通路进行了筛选和鉴定，通过免疫PCR阵列分析了促炎基因的表达，通过RT-PCR进一步分析，确定了香烟烟雾对小鼠致癌信号通路和促炎信号基因表达的影响。

☑4.无菌小鼠模型对实验结果的进一步验证

在文章的最后一部分，作者通过对无菌小鼠进行粪便微生物群移植（让无菌小鼠大量食用烟雾暴露组和无烟常规组小鼠的粪便）以及AOM处理，进一步验证了自己的实验结果。（图16A）通过对这些无菌小鼠的粪便进行宏基因组测序，得出的结论与第一部分的结论相似。

GF-AOMS组老鼠（germ-free mice gavaged with cigarette smoke exposed mice, GF-AOMS）和GF-AOM组小鼠（germ-free mice gavaged with stools from cigarette smokeexposed mice, GF-AOM）相比，两组无菌小鼠的肠道微生物多样性有显著不同，微生物聚类也存在显著差异。（图16B，C）对差异显著的34个细菌进一步分析，发现GF-AOMS组小鼠的迟缓埃格特菌显著高于GF-AOM组，狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)显著低于GF-AOM组，并通过定量PCR进一步进行了验证。（图16D、E、F）而这些结果与正常小鼠处理组的结果具有一致性。

接着作者发现与GF-AOM组相比，GF-AOMS组小鼠的结肠上皮细胞中Ki-67阳性细胞更多，PCNA表达水平更高。（图17A、B）

作者还对无菌小鼠进行了AOM处理，获得了GFAOM-AOMS（AOM treatment in germ-free mice and gavaged with stools either from cigarette smoke-exposed）组小鼠和GFAOM-AOM组小鼠（AOM treatment in germ-free mice and gavaged with stools from cigarette smoke-exposed，GFAOM-AOM）。结果发现GFAOM-AOMS组小鼠的结肠肿瘤数量和大小都显著高于GFAOM-AOM组小鼠。

最后，作者通过Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array技术，再次寻找被香烟烟雾影响的肠道菌群对小鼠致癌信号通路的影响。结果发现GF-AOMS组小鼠与GF-AOM小鼠相比，有9个基因表达上调，3个基因表达下调。而这些差异表达的基因显著富集于MAPK/ERK通路。同时，MARK/ERK通路中关键中介蛋白磷酸化水平也提高了，这说明在无菌小鼠处理组中MARK/ERK通路也被激活了。（图18A、B、C）

此外，无菌小鼠处理组中ERK蛋白磷酸化水平也和TDCA表达水平呈正相关。通过自身免疫反应和自身免疫PCR阵列，发现GF-AOMS较GF-AOM有16个促炎基因表达上调，且这些基因也主要富集在TNF通路和IL-17通路中，并且通过RT-PCR进行了进一步的确定。（图18D、E、F）

总之，在这一部分中，作者通过常规小鼠模型和无菌小鼠模型之间结果的一致性，进一步提升了自己实验结果的可靠性和可重复性，再次验证了香烟烟雾影响下的小鼠肠道菌群具有增加结肠中TDCA表达水平，激活小鼠致癌信号通路MARK/ERK，炎症相关信号通路IL-17，TNF，从而促进结肠肿瘤的发生。

03小结

在这篇研究中，作者的基本研究思路是A（吸烟）通过影响B（肠道菌群及其代谢物）促进了C（结肠癌）的发生。作者首先探究了A对C的作用，通过构建动物疾病模型等证明了A对C的促进作用。之后通过宏基因组测序，16s测序等方法，探究了香烟烟雾对小鼠肠道微生物多样性和其中微生物丰度的影响并对具体的微生物群落进行分析，从而定位到的丰度最高的微生物迟缓埃格特菌及他的重要代谢产物TDCA，将A和B联系在了一起。

接着利用 Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array和自身免疫PCR阵列对小鼠结肠上皮细胞的相关致癌基因进行了分析，找到了相关致癌信号通路，将B和C通过联系起来。最后通过无菌小鼠模型，进一步证明了自己的结论：吸烟可促进小鼠结肠直肠肿瘤的发生。