枢经推拿对神经病理性疼痛大鼠TLR8/ERK信号通路及LncRNA-GAS5的影响及作用机制研究

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是指由中枢支配的躯体感觉神经系统受损而导致的疼痛，属于难治性慢性疼痛综合征，通常表现为自发痛、触诱发痛、痛觉过敏以及感觉异常等临床症状，其持续时间一般超过3个月，影响患者睡眠质量，进一步引起患者焦虑、抑郁等情绪障碍，严重危害了患者的生活质量［1-2］。NPP仍是当前医学界亟待攻克的难题之一，其发病机制尚无完善理论解释，也无特效治疗方案，因此寻找一种安全高效的治疗方法迫在眉睫。古往至今，祖国医学对各种疼痛的病因、病机已形成较为系统的认识，在长期临床工作中中医药镇痛治疗NPP取得了不错的疗效，特别是近年来针灸、推拿等中医外治的镇痛效果也取得了一定进展［3-4］，相比于药物、外科治疗等镇痛方法，其经济安全、效果优良、不良反应少等优势受到广大医生和患者的青睐，成为临床关注的热点。然而，中医药在治疗NPP方面缺乏明确的镇痛机制且临床研究质量良莠不齐，使其无法在疼痛治疗中获得更高证据级别推荐，这有碍于中医药在临床上的进一步应用和推广。

 枢经推拿是基于枢经学说，强调以“枢”为主、“转”为精髓来总枢全身之气机，调转气血精液之运行为作用的中医推拿疗法。枢经是气机交接转枢之地，体现在转枢表里阴阳之气和通调脏腑之气，起到行气活血、疏通经络的功效［5］，因此体表少阳、少阴两枢的经络穴位在推拿手法的作用加持下，能更有效地缓解、消除疼痛，且NPP部位与受损区域有直接联系，故可尝试通过枢经推拿作用于受损区域来缓解疼痛。神经损伤会改变miRNA的表达，而miR-21作为其中的一员，已有研究证实其在神经保护和修复过程中发挥了重要作用［6-7］。作为丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族重要成员之一的细胞外调节蛋白激酶（ERK），经活化作用后进入细胞核，通过激活核糖体S6激酶使环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）磷酸化，从而调节其下游相关因子转录，参与突触可塑性，抑制神经元凋亡，介导神经元修复与再生等活动［8］。Toll样受体8（TLR8）是轴突生长的负调控因子及神经元凋亡的诱导因子［9］，最新研究表明，TLR8在NPP大鼠的脊髓背角中表达显著增加，miR-21是其内源性配体，TLR8通过miR-21的活化导致ERK磷酸化介导炎症介质的产生以及神经元的过度兴奋来参与NPP［10］，因此通过抑制miR-21介导的TLR8/ERK通路可能影响脊髓背角神经元的凋亡从而阻隔疼痛传递。长链非编码RNA-生长阻滞特异性转录因子5（LncRNA-GAS5）已证明与神经元的凋亡发生密切相关［11］，在前期的预实验中发现，LncRNA-GAS5在NPP大鼠脊髓背角中低表达，枢经推拿干预后表达升高，因此本课题组推断枢经推拿可能通过影响LncRNA-GAS5表达进而参与调控NPP的发生、发展和维持。基于此，本研究构建L5脊神经结扎（spinal nerve ligation，SNL）疼痛模型大鼠，观察枢经推拿对SNL大鼠脊髓背角组织中LncRNA-GAS5、miR-21基因、ERK、TLR8蛋白及其他涉及此通路的因子表达水平的变化影响，旨在深入探讨基于LncRNA-GAS5下枢经推拿对SNL大鼠的镇痛作用及机制，以期为临床枢经推拿治疗NPP提供有力的科学研究依据。

1　材料与方法

1.1　时间及地点　实验于2021年1—6月在广西中医药大学、广西大学动物医学实验中心完成。

1.2　材料

1.2.1　实验动物　选取120只健康、雌性SD大鼠，体质量140~160 g〔购于湖南斯莱克公司，使用许可证：SYXK（桂）2019-0004〕，在广西大学动物医学实验中心分笼饲养，饲养条件：室温20~25 ℃，湿度35%~45%，12 h自然光照，自由饮水进食。实验研究通过广西中医药大学动物实验伦理审查（No.DW20220621-129）。

1.2.2　主要实验试剂　注射用青霉素钠（齐齐哈尔市双富兽药有限公司，中国），水合氯醛（成都市科龙化工试剂厂，中国），焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（上海吉凯基因医学科技股份有限公司，中国），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，中国），兔抗鼠TLR8（Abcam，英国），兔抗鼠ERK（Abcam，英国）。

1.2.3　主要实验仪器　大鼠脑立体定位仪（Narishiga，日本），光学显微镜（奥林巴斯CX23，中国青岛），共聚焦显微镜（奥林巴斯BX43，中国青岛），酶标仪（OLYMPUS，日本），低温高速离心机（EPPENDORF，德国），Von Frey纤维丝测痛仪（Stoelng，美国），热板痛觉测试仪（IITC，美国），按摩推拿手法模拟仪（中华人民共和国发明专利号：ZL200710187403.1）。

1.3　实验方法

1.3.1　实验动物分组　大鼠适应性喂养7 d后，按随机数字表法分为正常组、模型组、假手术组、假推拿组和枢经推拿组，每组24只。模型组、假手术组、假推拿组和枢经推拿组进行造模。

1.3.2　实验动物模型制备　参照KIM等［12］的方法制备SNL大鼠模型，具体如下：（1）大鼠腹腔注射7%水合氯醛（按体质量4 mL/kg）深度麻醉。（2）清洁备皮，75%乙醇消毒后铺巾，将定位好的两侧髂后上棘最高点水平连线，与后正中线交点处沿左侧棘旁肌纵轴方向做一长约1.8 cm的切口。（3）钝性分离皮肤、筋膜浅组织及肌肉深组织，暴露L5椎体横突，随后用咬骨钳咬断L5横突和L4、L6锥体之间的骨性连接，充分暴露L5脊神经。（4）将暴露的L5脊神经用无创尼龙线双层紧密结扎，整个操作过程禁止过度牵拉脊神经。（5）最后予0.9%氯化钠溶液冲洗、彻底止血后逐层缝闭伤口。

造模成功标准：休息状态下可见大鼠出现经常性舔舐、术侧下肢后足悬空，活动状态下可见大鼠出现保护性悬起术侧下肢行为，无患肢瘫痪、拖步等运动障碍即可判定造模成功。

1.3.3　分组及治疗方法　造模成功后，正常组、模型组正常喂养、观察，不施加任何干预；假手术组切开组织暴露L5脊神经几分钟，不予结扎，并未造成神经实质性损伤；假推拿组在布袋的约束下轻抚大鼠双后肢18 min；枢经推拿组用自备按摩仪模拟点法、揉法、拨法，分别循序刺激两侧足少阳胆经上的环跳、阳陵泉、悬钟三穴，刺激力量为5 N，频率为2 Hz，每穴每法干预1 min，双侧6个穴位，3种手法，共计18 min。

1.4　主要观察指标　于造模前及造模后1、3、7、14 d分别进行行为学检测（机械缩足阈值、热缩足潜伏期），分别于干预7、14 d，随机抽取12只进行取材检测脊髓组织中介导TLR8/ERK信号通路相关蛋白表达情况〔脊髓组织脊髓组织B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表达水平，LncRNA-GAS5、miR-21基因表达水平〕。

1.4.1　机械缩足阈值测定　将大鼠放入底部铁丝网孔径为0.5 cm×0.5 cm的透明铁笼中，待大鼠适应周围环境后，分别用代表不同刺激强度的von-Frey纤维丝从底部铁丝网穿过，直接刺激大鼠左足底中心部位，刺激力度由小到大，观察大鼠出现缩足或抖足等阳性行为后停止刺激，并记录数据。连续测量3次，取平均值作为机械缩足阈值。

1.4.2　热缩足潜伏期测定　室内恒温25 ℃，热板痛觉测试仪置于有机透明玻璃动物笼内，将测试仪温度调至55 ℃后放入大鼠，并封闭盖子按下计时器。当观察到大鼠开始出现频繁抬足、舔爪等阳性行为后停止计时并记录时间。连续测量3次，每次间隔20 min，取平均值作为大鼠热痛缩足潜伏期。

1.4.3　取材　对大鼠禁食12 h后取脊髓背角组织并称重记录，取材使用的手术器械前一晚用0.1% DEPC处理水浸泡，以防止酶污染；按体质量4 mL/kg标准腹腔注射10%水合氯醛麻醉，回抽无血液回流方可注射，大鼠四肢无伸缩等动作即为麻醉成功；断头处死麻醉的大鼠后，迅速分离大鼠脊柱旁肌肉及组织，取出腰膨大段（L2~5）脊髓背角组织；随后使用液氮冷冻组织，置于-80 ℃冰箱冻存，标本使用期限应在3个月内。

1.4.4　大鼠脊髓组织Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表达水平检测　取1.4.3中部分脊髓组织，采用Western Blot检测组织内蛋白水平：测定目的蛋白含量，制备蛋白上样样本，采用10%分离胶，根据目的蛋白、内参的分子量进行切胶后转膜，再行免疫反应化学发光处理进行凝胶成像分析，最后使用Bio-Rad自带软件对各条带密度进行测定。

1.4.5　大鼠脊髓组织LncRNA-GAS5、miR-21基因表达水平检测　取1.4.3中部分脊髓组织，采用Trizol试剂提取相应组织和细胞中总RNA，采用Takara反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix（DRR036A）说明书，将RNA样本逆转录为cDNA，再根据2×Taq PCR MasterMix 试剂说明书进行实时荧光PCR扩增反应。

1.4.6　免疫荧光　所有切片需经过梯度二甲苯脱蜡（100%、90%、80%）及梯度乙醇水化处理（100%、90%、80%、70%）以备染色处理。各组切片浸泡PBS 5 min后滴加3% H2O2，在室温下孵育15 min；再用PBS充分洗涤后滴加山羊血清，室温孵育1 h。一抗NeuN（1∶400）在4 ℃冰箱留夜，次日PBS冲洗3次；二抗（FITC）避光常温孵育1 h，PBS冲洗3次；DAPI孵育25 min复染核，于荧光共聚焦显微镜下观察，使用ImageJ软件摄取各组荧光强度图片。

1.4.7　细胞凋亡检测　所有切片需经过梯度二甲苯脱蜡（100%、90%、80%）及梯度乙醇水化处理（100%、90%、80%、70%）以备染色处理；滤纸吸干切片组织周围的水分，滴加100 μL 1×蛋白酶K至各个样本上，置于37 ℃恒温下反应20 min；样本通透完毕后，PBS漂洗3次；其次，往各个样本中滴加100 μL TdT Equilibration Buffer，置于37 ℃恒温下反应10~30 min后利用吸水纸吸除样本中的TdT Equilibration Buffer；每个样本再滴加50 μL标记工作液，放入湿盒中避光反应1 h；将各个样本再次浸入磷酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗3次；同前吸干水分后，往各个样本滴加DAPI对细胞核进行复染；最后将各个样本浸入PBS漂洗4次；晾干后用含抗荧光淬灭剂（自备）的封片剂封片；使用ImageJ软件摄取各组荧光强度图片。

1.5　统计学方法　采用SPSS 25.0软件对数据进行分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　各组大鼠行为学表现

2.1.1　机械缩足反射阈值比较　造模前，各组大鼠机械缩足反射阈值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。模型组、假推拿组、枢经推拿组造模后1、3、7、14 d机械缩足反射阈值均低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组在造模后7、14 d机械缩足反射阈值与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；假推拿组、枢经推拿组的机械缩足反射阈值在造模后14 d均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组、枢经推拿组造模后7、14 d机械缩足反射阈值高于假推拿组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.1.2　热缩足反射潜伏期比较　造模前，各组大鼠热缩足反射潜伏期比较，差异无统计学意义（P>0.05）。假手术组、枢经推拿组在造模后1、3、7 d热缩足反射潜伏期均低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）；造模后14 d假手术组、枢经推拿组热缩足反射潜伏期与正常组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；假手术组、假推拿组、枢经推拿组在造模后7、14 d热缩足反射潜伏期均长于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；假手术组、枢经推拿组在造模后14 d热缩足反射潜伏期长于假推拿组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.2　脊髓组织中介导TLR8/ERK信号通路相关蛋白表达情况

2.2.1　脊髓组织中Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表达水平比较　造模后7 d，正常组Bcl-2蛋白表达水平低于其余各组，差异有统计学意义（P<0.05）；假推拿组、假手术组与模型组的Caspase-3、ERK蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。枢经推拿组的Bcl-2蛋白表达水平高于模型组，Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；枢经推拿组的Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表达水平均低于假手术组、假推拿组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3及图1。

造模后14 d，枢经推拿组的Bcl-2蛋白表达水平仍高于模型组，Caspase-3、TLR8蛋白表达水平仍低于模型组，而ERK蛋白表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），见表4及图2。

2.2.2　脊髓组织中LncRNA-GAS5、miR-21基因表达水平比较　造模后7 d，假推拿组和枢经推拿组LncRNA-GAS5基因表达水平均高于模型组，miR-21基因表达水平均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；枢经推拿组与假推拿组的miR-21、LncRNA-GAS5基因表达水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）；枢经推拿组LncRNA-GAS5基因表达水平高于假推拿组，miR-21基因表达水平低于假推拿组，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

造模后14 d，模型组lncRNA-GAS5基因表达水平低于正常组，枢经推拿组与假推拿组lncRNA-GAS5基因表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；枢经推拿组与假推拿组miR-21基因表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），见表6。

2.3　免疫荧光检测各组大鼠脊髓组织内神经元凋亡情况　用TUNEL/DAPI和NeuN/DAPI荧光染色定位观察神经元凋亡，结果显示，造模后7 d与正常组比较，模型组、假推拿组、假手术组、枢经推拿组中细胞凋亡（TUNEL阳性细胞）增多，神经元（NeuN阳性细胞）显著减少；而枢经推拿组与模型组、假推拿组比较，细胞凋亡减少，神经元数量较多，且神经元凋亡减少，见图3及图4。

3　讨论

对NPP的溯源发现，古代医学根据其临床表现将其归属“痹症”范畴。本次研究中的NPP大鼠模型背部肌肉疼痛、神经损伤，再结合其术后跛行、抬足等外观表现，无异于“痹症”临床症状，通过辨证分析其核心病机为气血痹阻筋脉。枢经推拿是基于枢经学说理论进行的推拿治疗，枢经学说理论源自《黄帝内经》，如《素问·阴阳离合论》曰：“太阳为开，阳明为阖，少阳为枢……”“太阴为开，厥阴为阖，少阴为枢……”；纵观历史各代医家对三种经脉作用如星罗棋布般的论述，其中较有代表的论述为“开阖统百病，枢统开阖”［13］。“枢经”是调节人体气血运行、脏腑功能平衡的中枢，因此气血津液的运行输布及脏腑生理功能的发挥在“枢经”调控下得以护卫，从而起到扶正祛邪、防病养生的关键作用［14］。足少阳胆经作为枢经之一，其位于人体之侧，循行周身众多筋肉骨节，而骨骼筋肉功能依靠着机体各功能的正常运作，其中气血的调和尤为重要；经络是气血运行的通道，推拿通过作用于枢经上的腧穴能够秉承调运全身气血运行之枢纽，尤以疏利胆经之气血，筋痹疼痛得以缓解。由此可见，干预NPP的关键经络是足少阳胆经，此次研究中使用的枢经推拿方式即选取足少阳胆经循行上的穴位进行点、拨、揉等推拿手法干预［15-17］。本研究结果显示，枢经推拿组与假推拿组的大鼠疼痛阈值相关指标机械缩足阈值与热缩足潜伏期较模型组均显著提升，即推拿通过升高疼痛阈值达到镇痛作用；而枢经推拿组的机械缩足阈值与热缩足潜伏期显著高于假推拿组，表明在枢经学说理论指导下进行推拿干预的镇痛效果更为明显。

NPP的疼痛以顽固性、难愈性著称，其发生、发展和维持机制盘根错节，目前尚无明确的效应机制和治疗方法，随着科学研究的不断深入，已有学者提出神经敏感化、肌肉伤害感受神经元的塑形化、门控理论等观点［18］，NPP形成的关键病理因素为神经损伤和炎症［19］。研究表明，神经元凋亡是许多神经损伤后引发神经元死亡的主要方式之一，神经损伤后，产生的痛觉信号传入脊髓刺激神经元释放促炎相关因子，从而引发炎症反应，诱导神经元凋亡，而神经元本身没有增殖修复能力，最终导致神经元对疼痛敏感性升高［20-21］。因此，阻断或减轻脊髓背角神经元凋亡，是缓解NPP的有效方式。

越来越多的研究发现，LncRNA可通过表观遗传和细胞凋亡调控许多疾病的发生、发展，逐渐成为近年来研究的热点，其中LncRNA参与NPP的调控引发广泛关注［22］。已有研究表明，在SNL大鼠脊髓背角存在大量LncRNA的差异表达，干预这些LncRNA能有效缓解疼痛，由此说明LncRNA在NPP的发生、发展过程中发挥着重要作用，其有望成为治疗NPP的新靶点［23］。GAS 5是位于1号染色体长臂2区5带的一类LncRNA，由12个外显子及11内含子组成，目前认为与神经元凋亡、血管重塑、炎症反应等生物行为相关［24］。ZHAO等［25］在大鼠实验研究中发现通过抑制LncRNA-GAS5水平可以显著降低凋亡基因BAX的水平，并提高抗凋亡疾病Bcl-2的表达水平，最终表明敲低LncRNA-GAS5的表达对脑梗死模型大鼠神经元凋亡具有抑制作用。ZHANG等［26］研究表明，LncRNA-GAS5通过加剧神经元糖酵解作用来诱导神经元细胞凋亡。除了直接调控细胞凋亡外，LncRNA-GAS5还可以发挥“分子海绵”的作用来吸附miRNA对靶基因起调控作用，进而在细胞凋亡中发挥作用［27］。已有研究证明，在神经元保护和修复过程中，miR-21被确认具有关键性调控作用［28］。KARL等［29］揭示了SNL大鼠脊髓和背根神经节（DRG）内miR-21的表达显著增加，鞘内注射miR-21抑制剂后，大鼠的机械性异常疼痛及热痛觉过敏均减轻，表明miR-21有望成为未来NPP治疗的下游靶点。本研究结果显示，造模7 d后，枢经推拿组与模型组、假推拿组比较细胞凋亡减少，神经元数量较多，且神经元凋亡减少，表明枢经推拿治疗可以显著减少SNL大鼠的神经元细胞凋亡。此外，模型组大鼠脊髓组织中LncRNA-GAS5表达水平低于正常组，而miR-21基因的表达水平高于正常组，提示miR-21在SNL大鼠中升高，与KARL等［29］研究结果一致。而与模型组相比，枢经推拿组的LncRNA-GAS5表达水平显著升高，同时miR-21表达水平显著降低，由此推测，枢经推拿作用于皮肤、肌肉等接收疼痛信号的外周躯体组织，略微阻断疼痛信号传至脊髓背角浅层，并刺激脊髓中的LncRNA-GAS5表达水平增长，LncRNA-GAS5发挥“吸附作用”使得miR-21表达水平降低，从而间接起到抑制神经元凋亡的作用。另外，通过比较7、14 d模型组和枢经推拿组中miR-21的表达水平可发现，模型组中miR-21的表达由高表达变为低表达，与之相反，枢经推拿组中miR-21的表达则由低表达变为高表达，考虑为14 d模型组大鼠随着机体的自然修复，疼痛逐渐减轻，因此脊髓中miR-21的水平降低，而枢经推拿组大鼠在推拿干预下可能涉及参与调控miR-21的负反馈机制，然而具体机制尚不明确，有待日后进一步研究探讨。

TLR8属于Toll受体家族成员，主要在中小型异凝集素B4非肽能神经元中表达，在病原体识别和先天免疫激活中起重要作用。已有研究证明，TLR8及其介导的信号通路在NPP的调控过程中以调控炎症反应和免疫应答的方式参与，其中TLR8的激活具有抑制神经突生长和诱导神经元凋亡的能力，表明TLR8是轴突生长的负调控因子和神经元凋亡的诱导因子［30-31］。ERK在神经保护中是关键酶之一，神经损伤会引起ERK磷酸化，ERK磷酸化后可上调BAD、BAX等促凋亡蛋白，并下调Bcl-2家族的抗凋亡蛋白以及激活凋亡终末效应器Caspase来触发聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）蛋白水解，从而促进神经细胞凋亡［32］。ZHANG等［10］研究发现，在SNL大鼠的脊髓背角中，TLR8表达显著增加，miR-21是其内源性配体，TLR8通过miR-21的活化导致ERK磷酸化介导炎症介质的产生以及神经元的过度兴奋来参与NPP。本研究结果显示，与模型组相比，枢经推拿组细胞凋亡诱导因子TLR8水平下调，miR-21介导的ERK蛋白也随之下调；与之相反，抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平上升，其通过抑制了人细胞色素C（Cyt-C）从线粒体释放，进而也降低Caspase-3的表达［33］，最终显著减少大鼠神经元的凋亡，缓解疼痛的发展，起到保护神经元的作用。

综上所述，本研究中推拿手法在枢经理论指导下通过干预足少阳胆经上的关键穴位可减轻疼痛部位的炎症反应，进一步调控脊髓背角神经元凋亡来达到缓解NPP的作用，其机制可能与通过上调LncRNA-GAS5的表达，下调miR-21以及调控TLR8/ERK通路上下游的相关蛋白和因子表达有关。本研究在一定程度上为临床枢经推拿治疗NPP提供了实验依据，初步推测LncRNA-GAS5是通过发挥“分子海绵”功能吸附miR-21介导TLR8/ERK通路相关蛋白抑制神经元凋亡，虽然其具体机制未明确证实，但LncRNA-GAS5有望成为未来治疗NPP的新靶点，今后可用miR-21抑制剂或基因敲除等方式进一步探究LncRNA-GAS5与miR-21、TLR8以及ERK的关系，更深入阐明枢经推拿对NPP的镇痛机制。

本文无利益冲突。

参考文献略

【引用本文】　韦宗波，龙炳材，王雄将，等.枢经推拿对神经病理性疼痛大鼠TLR8/ERK信号通路及LncRNA-GAS5的影响及作用机制研究［J］. 中国全科医学，2023，26（36）：4565-4574，4580. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0145.