一文搞定细胞永生化（Cellular Immortalization）理论+实践

1 背景知识介绍

永生化细胞（Cellular Immortalization）是一种在理化刺激、基因突变、病毒感染等外界刺激下， 可以在体外无限增殖的不衰老细胞株。细胞永生化机制有放射性因素、端粒-端粒酶激活、病毒基因转染及抑癌基因受抑制等学说[1]。胞永生化是指细胞在体外培养的过程中，由于自身基因变化或者外界各种刺激因素，避免了正常细胞的衰老死亡过程， 可以长期传代培养、无限分裂增殖[2]。

1.1 细胞永生化机制

衰老死亡是一种正常的不可逆的细胞生理过程，细胞在不断增殖分裂的过程中会到达衰老期M1期和致死期M2期[3]。细胞会停止分裂并启动凋亡程序。此时如果细胞在某些原因诱导下， 恢复基因的稳定性，则可以逃离衰老死亡的正常生理过程达到无限增值分裂的永生化状态。除干细胞、生殖细胞外，大部分真核生物细胞都具有该特性。例如人上皮细胞在分裂40至60代后就会停止生长，产生 DNA 合成蛋白抑制因子，保证 DNA 复制和染色体分配质量的检查机制就会发送细胞周期停止信号,阻止DNA合成，细胞不再分裂并开始衰老，而病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等则可越过衰老期而进入增长抑制状态，即危机期( M2 期) 。细胞在该周期中会逐渐出现退化、死亡的现象;只有罕见的细胞在某些因素的作用下可以激活端粒酶。为了补充或延长端粒，维持端粒长度，这些细胞以自身 ＲNA 为模板合成端粒 DNA， 从而维持染色体的稳定性，使细胞可以顺利跳过 M2 期，从而获得无限分裂增殖的能力，最终发生细胞永生化[5]。

1.2细胞永生化的术语

细胞永生化的专业术语[4]

2 促细胞永生化的几种方法

2.1 自发突变产生的永生化细胞(Spontaneous immortalization of cells)

细胞是在培养期间发生基因突变引起的，这些细胞逾越复制以及衰老的原理尚不清楚，且基因型不稳定，较易丢失有关来源组织的细胞特性。该方法大部分应用于啮齿类动物细胞的永生化 [6]。自然界中自发永生化的几率非常小，啮齿类动物为10-5 ～ 10-6，而人类细胞则小于10-12 [7]。

2. 2 化学致癌物以及射线因素产生细胞永生化

通过电离辐射、X 射线、核辐射、60Co 等照射处理细胞，使细胞通过射线照射诱导发生永生化。由于放射性元素破坏了细胞稳定性，使染色体重组，抑制抑癌基因的表达， 促进与细胞周期延长有关基因的表达，从而维持端粒长度， 使细胞老化过程不能正常进行，因此细胞将无限增殖[8]。1997 年 O＇Ｒeilly 等通过紫外灯照射 2 个人类皮肤角质细胞系后发现紫外灯照射能增加这 2 个细胞系的存活寿命[9]。使用化学致癌物方法使细胞永生化的原理与射线因素产生细胞永生化的原理相同，但是这两种方法都会使基因组产生部分随机损伤， 所以随着技术的先进化，这两种方法已经不再常见。

2.3 病毒感染诱导细胞永生化

将病毒通过转化感染到正常细胞中，可以改变基因，使部分细胞成功渡过两个致死期，得到无限增殖的能力，从而诱导细胞永生化[10]。病毒感染诱导细胞永生化是将整个病毒基因组导入细胞，这样会改变细胞表型，应用于病毒的特定宿主细胞且容易使细胞转化为肿瘤细胞。例如人乳头状瘤病毒、EB 病毒、猴肾病毒 SV40。

2.3.1 人乳头状瘤病毒( HPV)

人乳头状瘤病毒( human papilloma virus) 是一种对上皮细胞具有高度特异性的 DNA 肿瘤病毒，该病毒会引起细胞增殖，将正常细胞转化成乳头状瘤细胞。人乳头状瘤病毒的永生化率可达 105 [11]。在 HPV 编码基因中，占基因组 50% 的早期区表达蛋白含有 E1—E8 8 个阅读区，其中E6和E7两个阅读区编码相应蛋白， 可以改变细胞的末期分化，使细胞逾越保证 DNA 复制和染色体分配质量的检查机制，从而使细胞永生化。所以 E6和 E7 两个阅读区在细胞永生化中起到了关键作用。有实验表明被 HPV 感染的上皮细胞内端粒的长度停止缩短并不断增长，使细胞达到永生化[12]。

2.3.2 EB病毒

EBV 是疱疹病毒( Epstein-Barr virus) ， EBV 在体外能和培养的 B 淋巴细胞融合，进而感染 B 淋巴细胞，使基因通过显性表达改变细胞周期[13],使其正常细胞形成永生化的淋巴细胞系。研究发现 EBV 永生化 B 细胞的过程主要有 6 种病毒基因表达: EBV 核抗原1 ( EBNA1) 、核抗原 2( EBNA2) 、核抗原 3A( EBNA3A) 、核抗原 3C( EBNA3C) 、核抗原 LP( EBNA-LP) 以及潜伏膜蛋白1( LMP1)。EBNA1 在病毒的潜伏期和裂解周期, 都有表达， 在病毒的复制和分离中起着重要作用， EBNA1 是一种序列特异性 DNA 结合蛋白， 能帮助病毒基因与细胞有丝分裂染色体结合。 EBNA2 通过一个结构域传递信号以启动 B 细胞永生化，然后利用单独的结构域维持永生化 B 细胞生长，并EBNA2 能与 EBNA-LP 相互作用，共同激活。B细胞进行体外转化时，EBNA3A、EBNA3C、LMP-1 起到了至关作用。EBV 癌蛋白 LMP-1 组成型激活NF-κB，促进转化细胞增殖并抑制凋亡，对EBV永生化B细胞的存活至关重要。

2.3.3 猴肾病毒( SV40)

猿猴病毒 SV40 是由 LT（large tumour antigen） 和 ST （small tumour antigen）两种抗原及相关蛋白组成的简单的真核细胞病毒，由于猿猴病毒 SV40 对细胞生长、转化、瘤化的高效性，现在已应用于真核细胞生物工程实验。将 SV40 的T抗原片段整合到靶细胞核内进行表达，从而诱导细胞永生化，这可能是因为T抗原片段与 pRB-E2F复合体结合，使E2F 从pRB-LT复合体中分离出来，抑制细胞衰老，从而达到细胞永生化。

①大T抗原为细胞转化的启动所必需;②转化细胞表型的维持必需要有大T抗原的连续表达;③小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用.SV40病毒引起的转化是一个复杂的过程，目前尚难将转化细胞的生物学特性改变与SV40大T抗原的特异生化性质联系起来.一般有两种假说进行解释①SV40病毒编码的转化蛋白作用于细胞的质膜改变了细胞生长必需的功能;②转化蛋白作用于细胞核调节DNA复制和基因表达的部分.现知SV40的大T抗原大部存在于转化细胞的核内，与核质、染色质和核的基质联结在一起.

2.4 端粒-端粒酶激活诱导细胞永生化

端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构， 由简单的 DNA 串连重复序列和一系列相关的蛋白质组成，即DNA蛋白复合物。端粒 DNA 由若干个不含功能基因的简单重复的非编码序列构成。端粒的两条 DNA 链长度也不一样，以人为例,其中具有一条单链富含 GT，比它的互补链富CA单链多出 50～400 个核苷酸[13]。

端粒酶是一种合成和延伸端粒的核糖核蛋白。正常细胞内检测不到端粒酶活性，因此正常细胞分裂次数是有限的，不能无限增殖。但是恶性肿瘤细胞的增殖并不使端粒区缩短，因此具有无限增殖的能力，这是因为细胞中端粒酶被激活,它的作用在于补充细胞分裂中丢失的端粒，维系细胞稳定。

端粒酶由三部分组成: 端粒酶 ＲNA( telomerase RNA， TR 或 TRC) 模板、端粒酶相关蛋白( TPI) 和TERT。TERT的表达水平高低决定端粒酶活性，被认为是调节端粒酶活性的重要限速步骤之 一。TERT在进化上相对保守，几乎所有物种均含有 6个逆转录酶元件和1个端粒酶特异性元件。

2.5 不同细胞功能特征比较

3 永生化细胞系应用价值及意义

（1）   永生化细胞稳定均一，性状一致，是体外研究增殖、分化、凋亡、衰老等生物学过程的理想模型；

（2）   可使得传代困难，增殖困难、易衰老的细胞获得永生，并且永生化的细胞壁原代细胞易于培养，因为它们生长能力更强可以获得更多的细胞资源，也节省了分离细胞的周期，降低反复分离原代细胞的成本；

（3）   永生化的下拨和肿瘤细胞密切相关，是研究肿瘤发生机制的重要细胞模型；

（4）   永生化细胞可建立稳定的细胞库，遗传相同的种群，有助于提供一致且可复制的实验结果。

4 慢病毒细胞永生化步骤

4.1 慢病毒包装

表1 慢病毒包装质粒使用相关信息（10cm培养皿）

4.2 lipo 293TTM转染试剂

转染培养体系

5 慢病毒毒浓缩及感染原代细胞细胞

5.1 病毒浓缩

1、将病毒悬液（细胞培养基）收集，利用1250rpm，5min 后，去除细胞碎片或者细胞；

2、利用0.45μm的过滤器对病毒悬液过滤纸离心塑料管中（塑料管一放置超速离心机专用离心管中）；

（备注：塑料离心管是本实验的，使用前后均需要在75％乙醇浸泡。使用前浸泡15-20分钟，然后转移至生物安全柜中倒扣，不需要用用紫外照射。）

3、将20％蔗糖（用PBS稀释）4ml（根据实际情况而定）作为垫底液，轻轻的添加至塑料离心管的底部，然后小心的将病毒上清液添加至离心管蔗糖垫底液上；

4、将盖子扣在对应的离心管上，轻轻拧紧于电子天平称重（精准度0.1g），对于不足的使用PBS补充，1ml PBS = 1g；

5、按次序将所有 6个离心管放入超速离心转头中，执行100，000/ 125,000g X 2h/1.5h；

6、小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。

7、每管中加入适量1ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

8、将超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

9、在4 ℃ 溶解2小时每隔20分钟轻轻震荡。

10、4 ℃，500g 离心1分钟，使溶液集中于管底。

11、用 200μL移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28 离心管中。

12、集中后的病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

5.2 确定最佳的嘌呤霉素（puromycin）浓度

5.2..1 目标细胞的准备

1、准备好细胞，在传代以后至少要37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养过夜。

2、目标细胞必须达到80-90％融合率（confluent）放可加入puromycin进行筛选。

5.2.2 puromycin筛选目标细胞

筛选办法1：

首先是准备好puromycin，然后在使用的时候，保证puromycin的终浓度在1-10μg/ml以1μg逐步增加puromycin。

接着就是每天均需观察细胞的生长情况，同时还更换新鲜的含有puromycin的新鲜培养基。

最佳浓度的确定，在添加puromycin 3-5d后细胞完全死亡的puromycin浓度即为帅选靶细胞的最佳浓度。

筛选办法2：

逐步筛选，第一天用1μg/ml 筛选，同时查看blank细胞生长情况，直到筛选到能全部杀死blank细胞为最佳浓度。然后以次浓度对细胞进行稳定筛选（特别注意：刚传代的细胞一定不要急急忙忙的筛选，而是稳定培养1-2天后再筛选）

5.3 慢病毒颗粒感染和选择

5.3.1 目标细胞准备

同样地需要将研究的细胞进行复苏，扩大培养。在培养的细胞融合率confluent达到70％时，更换新鲜的培养（含有8μg/ml的聚凝胺<ploybrene>，聚凝胺能够增加病毒的感染效果，同时聚凝胺对某些细胞系是有毒，可以用硫酸鱼精蛋白<protamine sulfate>替代聚凝胺）

5.3.2 慢病毒颗粒感染目标细胞（target cells）

Day1：慢病毒感染细胞

收集好的病毒测量慢病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI），如果具有较高的MOI加入≥0.5ml，较低的MOI加入≤0.1ml（一般慢病毒的加入量是0.05-1ml），37℃ 5％ CO2 潮湿的细胞培养箱中培养过夜。

Day2：更换培养基

在慢病毒感染目标细胞以后，更换为新的培养基。如果观察毒性出现后，需要减少感染的时间至4-20小时。移除病毒包被液，需要在感染至少24小时后方可加入puromycin进行筛选。

Day3+：puromycin筛选细胞

更换含有puromycin培养基筛选细胞若干天后（一般来说会筛选1-2周），即可得到阳性克隆细胞。

5.4 细胞系的维持

一般情况，慢病毒感染筛选（药筛 or 流式筛选）以后，会持续培养50（左右），方能形成稳定的细胞系。当然建成细胞系以后也要做对应的检测，例如marker基因/蛋白、染色体核型分析、裸鼠成瘤、转录组学等等。

（写在最后，欢迎转载与引用，传播科学价值!!! 关注楼主GBhouse，如果有用，点赞+讨论是博主持续更新的动力！！！）

参考文献：

[1] 黄今, 杨融辉, 马海英. 细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展[J]. 东南大学学报：医学版, 2015(5):4.

[2] OBINATA M．Immortalized cell lines with differentiation potentials: their establishment and possible application［J］．Seikagaku，2008，80( 1) : 5-12．

[3] chosserer M , Grubeckloebenstein B , Grillari J . [Principles of biological aging].[J]. Zeitschrift Für Gerontologie Und Geriatrie, 2015, 48(3):285-294.

[4] Maqsood M I , Matin M M , Bahrami A R , et al. Immortality of cell lines: challenges and advantages of establishment[J]. Cell Biology International, 2013, 37(10).

[5] Haber, Daniel A . Telomeres, cancer, and immortality.[J]. New England Journal of Medicine, 1995, 332(14):955-6.

[6] 王珊珊, 王伟, 于莹莹,等. 人乳头瘤病毒癌基因诱导细胞永生化的研究进展[J]. 生命科学, 2012, 24(10):6.

[7] Katakura Y , Alam S , Shirahata S . Immortalization by gene transfection.[J]. Methods Cell Biol, 1998, 57(57):69-91.

[8] Childs B G , Baker D J , Kirkland J L , et al. Senescence and apoptosis: dueling or complementary cell fates?[J]. Embo Reports, 2015, 15(11):1139-1153.

[9] O'Reilly M S , Boehm T , Shing Y , et al. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.[J]. Cell, 1997, 88(2):277-285.

[10] A J K , A H L , A L H M , et al. Activation of human telomerase reverse transcriptase through gene fusion in clear cell sarcoma of the kidney[J]. Cancer Letters, 2015, 357( 2):498-501.

[11] Furukawa T , Duguid W P , Rosenberg L , et al. Long-term culture and immortalization of epithelial cells from normal adult human pancreatic ducts transfected by the E6E7 gene of human papilloma virus 16.[J]. American Journal of Pathology, 1996, 148(6):1763.

[12] Wang M L , Walsh R , Robinson K L , et al. Gene expression signature of c-MYC-immortalized human fibroblasts reveals loss of growth inhibitory response to TGFβ[J]. Cell Cycle, 2011, 10(15):2540-2548.

[13] 陈小云, 张敏, 王磊,等. 端粒酶在细胞永生化中的应用[J]. 中国兽药杂志, 2013, 47(4):5.