protocol 分享｜Far western 检测蛋白质相互作用
简介
Far western 实验主要是利用标记的探针蛋白通过凝胶电泳分离的目的蛋白质，从而探测和检测膜上的目标蛋白与探针蛋白是否具有相互作用。
原理
含有 A 蛋白的细胞裂解物中的蛋白质首先被 SDS 或 native PAGE 分离，并转移到膜上，就像在标准 WB中 一样。然后膜中的蛋白质变性并重新变性，用纯化的 B 蛋白封闭和探测膜。
如果 A 蛋白和 B 蛋白一起形成复合物，则在膜中 B 蛋白所在的斑点上检测到 A 蛋白。与其他生化结合测定相比，Far WB 允许 B 蛋白在不纯化的情况下内源性表达，与大多数使用细胞裂解物（例如，共免疫沉淀（co-IP））或活细胞（例如，荧光共振能量转移（FRET））的方法不同，Far WB 可确定两种蛋白质是否直接相互结合。
用途
验证两个目的蛋白之间是否具有直接相互作用。
材料与仪器
PBS、SDS-PAGE、PVDF 膜、BSA、PBST
显色液、待检测蛋白和相应抗体
SDS-PAGE 电泳仪
蛋白质标记剂（例如放射性标记剂或荧光标记剂）
蛋白质转移膜 （例如 PVDF 或 NC 膜、电泳缓冲液
Western blot 检测试剂盒（例如抗体、辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶体系等）
步骤
1、准备蛋白质样品将目标蛋白质和探针蛋白质分别制备：将目标蛋白质和探针蛋白质分别加入 SDS-PAGE 电泳缓冲液中，使其浓度达到合适的水平（通常为 1~10 ug/pl）。
2、将样品加入 PAGE 胶中并进行电泳，电泳时间和电压根据所用的胶和蛋白质分子量而定。电泳结束后将胶从板上取下。
3、将电泳胶用传输缓冲液在膜上转移。转移时间和电压根据所用的胶和蛋白质分子量而定（100 V 电压转膜，每 1 k Da 蛋白转膜 1 min）。
4、蛋白质固定： 用 20% 甲醛溶液或热处理方法将膜上的蛋白质固定 30 min。
5、探针蛋白质的检测：用放射性标记剂或荧光标记剂标记探针蛋白质。将标记后的探针蛋白质加入含有 3% 牛奶粉或 BSA 的 TBST 缓冲液中进行孵育以防止非特异性结合。孵育时间一般为 1~2 小时。
6、目标蛋白质的检测： 用目标蛋白质作为目标分子，将其加入含有3%牛奶粉或 BSA 的 TBST 缓冲液进行孵育，孵育时间一般为 1~2 小时。然后用 Western blot 检测目标蛋白质是否与探针蛋白质结合。
7、使用适当的抗体和检测试剂，对膜进行染色和成像，检测目的蛋白和探针蛋白是否定位在同一位置。
注意事项
1. 控制膜上探针蛋白质的浓度，避免过多的探针蛋白质覆盖目标蛋白质。
2. 选择合适的靶蛋白质浓度，避免目标蛋白质浓度过高或过低影响检测结果。
3. 确保目标蛋白质不会与其他蛋白质相互作用，否则可能会导致假阳性结果。
4. 选择合适的探针蛋白质，确保其与目标蛋白质具有高亲和力和特异性。
常见问题
1. Farwestern 实验中如何选择合适的探针蛋白质？
答：选择具有高亲和力和特异性的探针蛋白质，最好是已知目标蛋白质的互补 DNA 或 RNA 序列。
2. Farwestern 实验中如何控制探针蛋白质的浓度？
答：控制探针蛋白质的浓度，避免过多的探针蛋白质覆盖目标蛋白质。
3. Farwestern 实验中如何选择合适的靶蛋白质浓度？
答：需要对不同的靶蛋白质进行优化，以确定最佳浓度。
4. Far western 实验中如何避免假阳性结果？
答：确保目标蛋白质不会与其他蛋白质相互作用，选择合适的探针蛋白质，确保其与目标蛋白质具有高亲和力和特异性。
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最后编辑于 2023-06-30 · 浏览 1174
