电转效率只有10的4次方，热转化都有5次方，哪一步出了问题

感受态制备：

将冻存的TG1甘油菌在2 YT平板划线，挑取单菌落转50 mL 2 YT液体培养基，培养10 h后取2 mL转200 mL2 YT液体培养基，当OD到0.5时取出，冰浴30 min。一管100 mL分装至预冷灭菌的50 mL EP管中，之后全程冰上操作

4℃ 5000 rpm离心10 min，弃上清

加入预冷10%甘油30 mL，沿瓶壁缓慢加入，冰浴吸打重悬沉淀，静置20 min

4℃ 5000 rpm离心10 min，弃上清，加入预冷10%甘油30 mL，沿瓶壁缓慢加入，冰浴吸打重悬沉淀，静置15 min

4℃ 5000 rpm离心10 min，弃上清，加入预冷10%甘油30 mL，沿瓶壁缓慢加入，冰浴吸打重悬沉淀，静置10 min

4℃ 5000 rpm离心10 min，弃上清，加入1 mL预冷10%甘油吸打重悬。每管100 μL分装（EP灭菌，预冷）。

转移-80℃ 30 min。

电转操作：

电转杯以75%乙醇浸泡2 h，超净台与紫外灯平行，吹干，至于冰上预冷

在冰上放置感受态解冻，加入重组质粒2μL，即10 ng（一管纯化后5 mM Tris洗脱再稀释5倍，另一管使用ElectroLigase，未纯化），轻击管底混匀，冰浴6 min

将感受态与质粒混合溶液加入电转杯中，敲击去气泡，并擦干

放入电转仪进行电转

迅速加入37℃ 900 μL SOC培养基于电转杯中，吸打混匀后转移至灭菌的EP管，200 rpm，37℃复苏2 h，吸取100 μL涂布于Amp 2YT平板（100 μg/ml Amp）