干货笔记|糖化血红蛋白系列二 IFCC糖化测定参考方法介绍

随着Hb A1c定义的明晰以及其在临床上的应用越来越被认可，准确测定Hb A1c的值就显得非常重要。而参考方法的建立，对于临床实验室结果的准确性以及溯源性，至关重要。但是，Hb A1c的测定，直到2002年，还没有全球范围内认可的参考方法。IFCC的Hb A1c标准化工作组研发了HbA1c参考方法并将其成果发表于2002年的《临床化学检验医学》杂志(Clin Chem Lab Med)上1。接下来，本文就简单介绍IFCC的糖化检测参考方法。

  首先，制备血红蛋白混合物--分离制备出人红细胞，将其用HPLC级水溶解后用pH6.2的保存缓冲液储存；制备蛋白酶酶解血红蛋白多肽混合物--用Glu-C蛋白内切酶将前面制备的血红蛋白水解切成多肽；然后，定量糖化和非糖化的六肽产物--通过HPLC和电喷雾离子质谱法或HPLC串联带紫外检测的毛细管电泳分离和定量制备出β链N-段的糖化和非糖化的六肽。最后，计算Hb A1c的结果--通过糖化的六肽和非糖化的六肽两者的比率计算糖化结果。当然，在计算结果时，要用校准品校准系统。结果表明，两套参考方法的结果高度一致。参考方法中用到的校准品为高纯度的Hb A1c(纯度≧95%)和Hb A0(纯度≧99%)的混合物。这些校准品也要用Glu-C蛋白内切酶裂解后检测分析才能用于校准计算。

欧洲、日本和美国的参考实验室性能分析显示，室内CV介于0.5-2%，室间CV为1.4-2.3%，非常优良。也对常见的一些干扰因素如，甲酰化、乙酰化血红蛋白进行过认真调查，结果表明抗干扰能力较强。不过对于变异体Hb S和Hb C,IFCC的参考方法没办法进行糖化检测，因为其b链的第6位氨基酸残基Glu分别突变为Val和Lys，Glu-C蛋白内切酶裂解得不到六肽产物。同时，由于d链和b链的前六个氨基酸残基一样，用Glu-C蛋白内切酶裂解Hb A2(α2d2)，也会产生同样的糖化的六肽和非糖化的六肽，会有一定的干扰。同现有的商业方法相比，由于参考方法的特异性高，商用方法的校准品特异性低，前者的Hb A1c值会稍低于后者的。

尽管IFCC的糖化血红蛋白检测的参考方法结果比较准确，特异性好，但由于操作比较繁琐，费时，对操作人员的要求又比较高，仪器系统也相对较昂贵，检测成本高，故其在临床实验室难以推广，不适合病人的糖化血红蛋白蛋白检测。