【做科研的大师兄】手把手带你完成一篇30+大子刊课题设计到逻辑证明的深度剖析！

本文就是针对大师兄文献带读第一期#1的深度文字总结版！

大师兄文献带读第一期#1，给大家带读的文献是这篇2023.4.20在大子刊Nature immunology上线的研究论文。

本文通讯作者是来自于美国西奈山医学院的Miriam Merad教授。该教授主要研究领域是巨噬细胞、DC等免疫细胞在肿瘤及其它免疫性疾病的作用及机制揭示，此前，Miriam Merad已经发表多篇CNS主刊及大子刊文献，非常值得追踪该课题组的研究进展，跟进研究前沿。

为了方便大家理解，我们首先看下这篇文章提出并最终证明的一个Work model（如下图）是怎样一个因果上下游的逻辑关系，随后再通过文献中的具体结果为大家逐渐展开本研究的科研逻辑是如何逐步构建起来的。

以上work model拆解如下：

• 主要表型：通过实验证实了NSCLC中mo-macs确实通过抑制NK激活导致免疫抑制微环境形成，进而导致免疫逃逸，发挥促癌作用。
• 上游机制：研究发现胞葬作用激活mo-macs的TREM2 program，且TREM2介导mo-macs胞葬后对TREM2 program激活，表现为免疫抑制特征。
• 下游机制：研究发现TREM2+mo-macs上调IL18BP同时下调IL18，IL18BP与IL-18竞争性结合IL18R，阻断NK细胞激活，并且TREM2+mo-macs可以抑制DC细胞IL-15的分泌，进一步抑制NK细胞激活。

本文是如何一步步构建并证实以上work model的逻辑框架的呢？接着我们进入文献带读正题啦。

首先，看下这篇文章的introduction如何进行背景引入的？

1.NK细胞在肿瘤组织中普遍缺失，且功能失调，机制不清；

2.肿瘤表达的MHC-I类分子（HLA-A/B/C/E）增强CD8 T细胞的抗肿瘤免疫，然而却抑制NK的抗肿瘤免疫；肿瘤细胞为了逃避CD8 T细胞抗肿瘤作用，普遍下调MHC-I类分子，逻辑上应该促进NK细胞的抗肿瘤作用，然而事实并非如此，提示NK细胞功能处于失调状态；

3.因此，阐明肿瘤中NK细胞减少及功能失调的机制，对于重新增强抗肿瘤免疫非常重要，但目前这方面尚缺乏充分研究；

4.既往研究表明肿瘤中NK显著减少，而单核巨噬细胞（mon-mac）显著增加，且已经发现mon-mac发挥免疫抑制作用，然而mon-mac如何获得免疫抑制特征的机制尚不清晰；

5.TREM2最先发现表达于小胶质细胞（脑部一种组织定居巨噬细胞），通过感应髓鞘碎片，激发吞噬髓鞘碎片的作用，既往研究已经证实在人和小鼠的多种肿瘤组织中mon-mac表达TREM2，且主要发挥抑制抗肿瘤免疫作用，肝癌中相反，具有组织特异性。

通过以上背景介绍，提出本研究聚焦的科学问题：非小细胞肺癌NSCLC中NK细胞为何缺失及功能失调，TREM2+ mon-mac的作用是什么？

为了探究该科学问题，开始实验，也就自然进入了results部分的解读。

#1 肺癌肿瘤微环境中TREM2 mo-macs显著增多，NK细胞减少，二者负相关

该研究首先分析了之前已发表文章中的肺癌单细胞测序数据，结果表明，肺癌组织（肿瘤微环境），相比于癌旁（相对正常）组织，NK细胞显著减少（图a，左侧），而mo-macs显著增多（图a，右侧）。继续分析单细胞数据，发现肺癌组织中，NK细胞的量和单核来源巨噬细胞（mo-macs）的量显著负相关（图b，左侧），而组织驻留巨噬细胞（AMs）的量与NK无显著相关性（图b，右侧）。这一结果提示mo-macs在肺癌组织中应该具有不同于AMs的功能，而且极可能发挥抑制NK细胞的作用（负相关的提示）。

为了进一步探究mo-macs具体有什么不同于AMs的功能，继续分析单细胞数据中mo-macs和AMs之间的差异表达基因（不同分组进行测序，并分析差异基因是进行功能探究常用的方法），发现其中有多个上调基因，包括TREM2（图c），于是将这些差异表达基因定义为了TREM2 program。

接着，为了证实TREM2 program（或叫signature）的主要表达细胞类群，也继续分析单细胞数据，发现主要高表达在mo-macs（图d）。这提示TREM2 program主要是mo-macs特异性表达。为了揭示肺癌中这群TREM2+mo-macs的功能，继续将TREM2 program中包含的基因进行了通路富集分析（通路富集分析是功能注释常用的方法），结果揭示最显著富集的四条通路包括IL-18信号、IL-1相关信号通路、吞噬囊泡形成、溶酶体相关通路（图e）。

这四种富集到的通路如何解读？则需要一定的文献积累，当具有文献积累后就可以找到这四种同路的共同之处，那就是他们都是和巨噬细胞的胞葬作用相关，于是提示TREM2+ mo-macs应该是和胞葬作用有某种关系（这也是后续研究切入点的依据）。

最后，除了单细胞测序数据分析的结果，本研究还做了多重免疫荧光，证实了在人肺癌组织中TREM2+ mo-macs确实是存在的（单细胞测序分析结果一般都需要免疫荧光验证），图中CD68是mo-macs的标记基因（图f）。

基于第一部分实验结果，得到以下结论：NSCLC中，mo-macs显著增多，NK减少，二者负相关，其中mo-macs高表达TREM2 program。

接着，本研究继续回答的问题是：NSCLC中，mo-macs是如何上调其TREM2 program，使其与组织驻留AMs不同的。也就是上游机制问题？

#2 胞葬作用促进mo-macs上调TREM2 program

首先解释一下胞葬作用。所谓胞葬作用，是指巨噬细胞吞噬凋亡细胞的过程，该过程分为几步完成（如下图，稍作了解即可）。已有研究表明，胞葬作用可以诱导巨噬细胞的免疫抑制表型。

上游机制的探究，为什么要做胞葬作用呢？本研究主要从几点进行思考。

1.TREM2介导小胶质细胞吞噬髓磷脂碎片（introduction文献背景）；

2.Mo-mac是TREM2 program的主要表达细胞（Fig1数据分析结果）

3.TREM2 program富集通路与胞葬密切相关（Fig1数据分析结果）；

4.TREM2可以识别凋亡细胞表面磷脂（results文献背景）。

综合这4点，可以提出上游机制的科学假设：胞葬作用很可能是激活mo-macs中TREM2 program的上游机制。

接着，就是做实验证实该假说。通过绿色荧光GFP标记肿瘤细胞，红色荧光标记TREM2+mo-macs，免疫荧光实验证实TREM2+mo-macs可以吞噬GFP标记的凋亡肿瘤细胞（绿色荧光较弱，细胞皱缩的细胞被认为是凋亡的肿瘤细胞，绿色和红色有重叠，可以证明以上结果）（图a）。

为了进一步明确胞葬作用对mo-macs的作用，这里进行了一个值借鉴的实验设计。通过流式分选出GFP-hi和GFP-low的mo-macs，分别代表胞葬作用强和弱两组，然后针对分选的细胞进行了RNA-seq（图b）。当然测序后接着就要分析这两组（胞葬强vs胞葬弱）mo-macs中的差异基因（这是进行功能探究的常用方法，当你不知道某一分组有什么作用的时候，可以借鉴此方法，那就是进行组学大数据分析，然后进行差异分析）。

通过分析差异基因，火山图展示中可以看到胞葬作用强（GFP-hi）的mo-macs是有显著上调TREM2 program的基因（包括TREM2、LPl、Syngr1、ApoE），同时也可以上调一些免疫抑制性的基因，包括CD274（PD-L1）等（图b）。

接着，以柱状图（图c）继续展示了上述差异基因，展示了GFP-hi（胞葬作用更强）的mo-macs可以显著高表达TREM2 program相关基因（Trem2, Lpl, Syngr1 and Apoe）且显著富集免疫抑制性基因包括（可看results原文找到对应关系）：Cd274；lipid metabolism genes；antigen uptake and trafficking（图c）。同时还通过点线图（图d, e），展示了GFP-hi（胞葬作用更强）的mo-macs中胆固醇代谢（图d）和细胞迁移相关基因的表达（图e）。本文关于图d和e的结果展示，只是在此处出现，只是客观描述了胞葬对mo-macs的这两个通路的影响，在后文其他位置和整个课题因果逻辑环路中的意义不是很大。

最后为了进一步证明胞葬作用对mo-macs的TREM2 program的上调，又加了一个体外实验（体外更直接），考察胞葬作用有和无对于mo-macs的TREM2 program表达的影响。体外直接将凋亡的肿瘤细胞加入到mo-macs（胞葬就是巨噬细胞吞噬凋亡细胞，所以直接加凋亡肿瘤细胞促进胞葬的发生），QPCR实验证实了确实可以显著上调TREM2 program相关基因的表达（图f）。

基于第二部分结果，得到以下结论：NSCLC中，mo-macs高表达TREM2 program的上游机制如下图。

接着，既然上游做清楚了，需要继续往下游探究，胞葬作用诱导的mo-macs上调TREM2 program究竟在NSCLC中发挥促癌还是抑癌作用？

#3 TREM2 mo-macs发挥促癌作用，且TREM2是激活mo-macs中TREM2 program逻辑上游的因

基于前期数据+文献背景，提出本部分的科学假设：TREM2+mo-macs很可能发挥促癌作用（如下图所示提出科学假设）。

接着就是做实验去证实该科学假设。这里首先通过构建TREM2基因全敲除小鼠，发现TREM2敲除后，可以显著改善肺癌荷瘤小鼠的生存（图a），肺部肿瘤负荷（图b）。而且单细胞测序证明TREM2全敲后可以显著改变肺癌肿瘤微环境免疫细胞组成，主要是导致mo-macs减少，以及DC细胞（增强抗原提呈，发挥抗肿瘤免疫作用）增多（图c）并通过流式（图d-f）进行了验证（单细胞测序结果需要流式分析证实）。这提示TREM2全敲后可以激活肿瘤微环境的抗肿瘤免疫。

以上结果说明TREM2基因敲除后是会导致一个免疫激活及抑癌表型。那么TREM2敲除后导致的这一表型改变是否是因为mo-macs中的TREM2缺失所导致的呢？为了解答这个问题，继续进行后续嵌合体小鼠模型的实验。

这个嵌合体小鼠模型是如下进行的：首先将相同遗传背景的C57小鼠分为三组（WT+KO+chimera），然后将这三组小鼠骨髓清除，再分别向这三组小鼠输入三种骨髓细胞。分别是WT小鼠骨髓细胞（CD45.1标记），TREM2 KO小鼠骨髓细胞（CD45.2标记，这里模拟对mo-macs进行TREM2的条件性敲除，因为前面数据已经表明在TREM2最主要表达于mo-macs）和嵌合体（WT：TREM2 KO为1:1混合）小鼠骨髓细胞，然后再同时接种肺癌模型，观察对肿瘤恶性表型的影响。结果表明，mo-macs中的TREM2敲除可以发挥明显抑癌作用，而嵌合体小鼠的抑癌作用介于WT和KO之间（图g）。

接着，利用嵌合体小鼠模型的肿瘤组织做了一个单细胞测序，分析结果证明TREM2是导致mo-macs中TREM2 program激活的一个上游因而非下游果（图h）。如何证明的呢？嵌合体组（Chimera）小鼠是将WT和TREM2 KO的mo-macs按照1:1数量混合后打到背景小鼠体内，然后让他们接受完全一样的微环境，这种情况下，发现相比于WT组mo-macs，TREM2 KO的mo-macs中TREM2 program的表达明显下降。由此证实TREM2是激活mo-macs中TREM2 program的因。

基于第三部分结果，得到以下结论：TREM2 mo-macs发挥促癌作用，且TREM2是激活mo-macs中TREM2 program逻辑上游的因。

既然TREM2 mo-macs发挥促癌作用，那这种作用背后的机制是什么，便是下一步要探究的问题。

#4 TREM2 mo-macs通过上调IL18BP及抑制树突状细胞（DC）IL-15进而抑制NK细胞发挥促癌作用

为了回答以上问题（TREM2 mo-macs发挥促癌作用的机制是什么），基于第二部分实验结果，提示TREM2 mo-macs具有免疫抑制性特征，提示很可能通过免疫抑制发挥作用。于是通过实验检测了TREM2 KO之后对于两种最重要的直接杀伤肿瘤的免疫效应细胞NK细胞和CD8T细胞进行检测。结果表明，TREM2 KO后，可以显著促进CD8+T细胞（图a）和NK细胞（图b，c）增加。

基于这部分实验结果+文献背景（CD8+T和NK发挥抗肿瘤免疫作用），提出这一步的科学假设：TREM2+ mo-macs很可能通过抑制CD8+T和NK细胞发挥促癌作用。

接着就是证实以上科学假设是否成立。证明的方法就是rescue实验（回补实验，因果关系论证的逻辑基础是柯霍氏法则）。通过回补实验，分别用抗体删除了CD8T细胞、NK细胞，以论证TREM2 mo-macs的促癌作用是依赖于CD8 T细胞还是NK细胞。结果表明，只有NK细胞删除后，TREM2 KO的抑癌作用被rescue，而CD8 T细胞删除后基本没rescue效果（图d）。同时实验也发现TREM2 KO之后肿瘤细胞表面介导NK靶向杀伤的受体也有下调（图e）。

以上结果修正了科学假设为初步结论：TREM2 mo-macs的促癌作用是通过NK细胞发挥作用的。于是整个研究的work model初步成型如下：

接着需要继续回答的问题是：TREM2 mo-macs的促癌作用如何通过NK发挥促癌作用？

那么如何找到研究靶点去切入TREM2 mo-macs通过NK发挥促癌作用的机制呢？这是课题研究需要从文献中借鉴的思考角度。

本研究思考角度如下：既然TREM2激活mo-macs中的TREM2 program发挥促癌作用；而TREM2 program通过通路富集分析（Fig 1数据结果）最显著的为IL-18信号通路；结合文献调研（隐藏的文献背景，自己查一下便知，文中并未提及），IL-18是发挥激活NK作用的；而实验结果发现TREM2是抑制NK细胞的。这种结果看起来相互矛盾。

于是需要继续通过分析TREM2 mo-macs富集的IL-18通路中具体是哪些基因变化，发现IL-18BP显著上调，而IL-18本身下调（图f）。这里就实现了逻辑互洽，因为IL-18BP的作用和IL-18是相反的（文献已知），它可以和IL-18竞争性结合NK细胞表面的IL-18R受体，导致IL-18无法激活NK，发挥促癌作用。由此，提出科学假设：TREM2 mo-macs通过IL-18BP竞争性结合IL-18R导致NK抑制，进而发挥促癌作用。

接着就是针对科学假设的逻辑上下有关系进行因果论证，本质就是rescue实验，逻辑依据是柯霍氏法则。通过靶向科学假设中的三个逻辑节点（下图中的绿色箭头所示为靶向的逻辑节点），实验证实这一科学假设。

结果表明，敲除NK细胞表面的IL-18R，可以显著逆转mo-macs中TREM2 KO所致的NK激活表型（图g）。而用单抗阻断IL-18，可以逆转mo-macs中TREM2 KO所致的抑癌表型（图h），同时逆转NK细胞的激活（图i）。以上实验针对的逻辑节点（IL18，IL-18R）扰动，可以显著逆转上游逻辑节点（TREM2+ KO）所致的表型，就证明了以上科学假设的逻辑是正确的，科学假设成立。

接着，由于文献中已有报道，IL18激活NK细胞依赖于DC的IL15（文献已知），既然mo-macs中TREM2 KO的抑癌作用依赖于IL-18对NK的激活，且实验数据分析也发现TREM2 KO上那条DC中IL15（图a）。那该过程是否也同样依赖于DC分泌的IL15呢？本研究针对这一科学问题，进行了逻辑证明。也就是证明下图中黄色串联出来的科学假设。这里同样利用rescue实验，靶向的逻辑节点当然就是IL-15（下图绿色箭头所示）。

实验结果表明，单抗中和IL-15可以显著rescueTREM2 KO所致的抑癌表型（图b）及对NK的激活（图c）。这边证明了以上科学假设的成立。

基于第四部分结果，就完成了本研究完整work model的提出及逻辑证明。

• 主要表型：通过实验证实了NSCLC中mo-macs确实通过抑制NK激活导致免疫抑制微环境形成，进而导致免疫逃逸，发挥促癌作用。
• 上游机制：研究发现胞葬作用激活mo-macs的TREM2 program，且TREM2介导mo-macs胞葬后对TREM2 program激活，表现为免疫抑制特征。
• 下游机制：研究发现TREM2+mo-macs上调IL18BP同时下调IL18，IL18BP与IL-18竞争性结合IL18R，阻断NK细胞激活，并且TREM2+mo-macs可以抑制DC细胞IL-15的分泌，进一步抑制NK细胞激活。

#5 靶向TREM2可以增强NK细胞介导的抗肿瘤免疫，增强治疗效果

既然已经完成了本研究的work model的提出几论证，最后就是靶向提出的这个work model进行肿瘤治疗的临床转化意义角度的探究。

这里就涉及靶点选择，因为work model中有很多逻辑节点，究竟选哪个进行靶向呢？首先要选择的是靶向表型的逻辑起点，也就是TREM2 mo-macs，通过TREM2的抗体靶向阻断TREM2 mo-macs，发现可以起到和敲除TREM2同样的肿瘤抑制效果（图a，b），这就体现出了TREM2单抗的免疫治疗意义（敲除基因无法用于治疗，注射单克隆抗体是常用的肿瘤免疫靶向治疗方法）。

接着，通过阻断TREM2的同时，激活NK细胞（联合治疗，双靶标激活，下图绿色箭头），可以发挥比单独阻断TREM2更好的治疗效果。而且，清除掉NK细胞之后，这种治疗效果就消失了（体内rescue）。这不仅证明了联合治疗的效果，而且在逻辑上，进一步支持了TREM2就是通过影响NK发挥作用的。

至此，本研究结束。

我们总结一下大子刊上文章的课题设计及逻辑证明方法如下图。这种方法是我们自己在进行课题设计及逻辑证明过程中必须遵循的步骤，唯有如此，研究性论文才能发表到较高质量的期刊。

那么本研究有哪些不足之处呢，也就是我们需要通过critical thinking找出哪些需要进一步完善的地方。总结如下，供大家参考。

最后探讨一下针对本研究的终极问题（必看！！！）：

1. 本研究真的如文中story所述进行先后逻辑展开的吗（课题最开始究竟是怎么想到去关联mo-macs和NK之间的关系呢，毕竟免疫细胞那么多）？

2. mo-macs相比于AMs的差异基因那么多，TREM2也不是变换最显著的，为什么要选择TREM2作为课题提出work model的hub gene？

由于以上问题不会在文章中直接告诉我们，都是藏而不发的，而往往这才是做课题最重要的一点，那就是我们是如何思考选题，或做出这种高质量课题的。所以，这里与大家做一下探讨是非常有必要的。

根据科研经验，本文最原始的课题起点很可能是以TREM2这个基因作为起点，通过基因敲除鼠发现TREM2 KO后对NSCLC具有显著的抑癌作用，由此产生了这个课题。接着是对TREM2表达细胞进行筛选，发现mo-macs是TREM2的主要表达细胞，由此确定了TREM2 mo-macs很可能是TREM2 KO后发挥抑癌作用的关键。接着进行了TREM2 KO的单细胞测序，找到了对NK和DC的影响。在这些前期数据的基础上，结合文献调研及逻辑推理构建，即可设计出本研究work model的主体框架，及TREM2 mo-macs—DC—NK细胞之间的可能调控框架。再进行TREM2 mo-macs的单细胞数据差异基因分析及通路富集，即可设计出本研究的分子机制层面，即TREM2 mo-macs—IL-18BP—DC—NK细胞。这也就解释了，为何文章开头直接看mo-macs和NK的相关性。

当按照以上原本思路完成本研究之后，进行sci写作时，可以调整顺序，进行story的重构，以体现出更宏大的研究的意义。试对比：story#1—TREM2基因对mo-macs的作用，进而影响肿瘤免疫，从单基因出发的典型研究思路，不够新颖和吸引力；story#2：以临床问题出发，及NK在肿瘤中缺失及功能失调为切入点，探究TREM2 mo-macs是导致NK缺失及失调的重要因素，所以对肿瘤治疗意义重大，如此就彰显文章的课题设计的意义，而且这种从更宏大的问题而非单基因出发的模式更有新颖性和吸引力。因此本文写作选择story#2的写作模式。

好了，以上就是第一期文献带读的深度文字解读版，也是读懂文献的范本，希望你能有所获益！