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protocol 分享|乙酰化 RNA 的免疫沉淀

发布于 2023-06-09 · 浏览 621 · IP 浙江浙江
这个帖子发布于 1 年零 336 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

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简介

A-RIP 技术是利用抗体特异性识别并富集细胞中乙酰化 RNA,随后将其沉淀,分离纯化后可进行下一步的 RNA 测序和 RT-qPCR 等分析。

用途

A-RIP 技术可以用于检测细胞中乙酰化 RNA 的种类和分布,筛选新的 RNA 乙酰化修饰底物和酶,以及探究 RNA 乙酰化修饰在基因表达调控、细胞分化和肿瘤发生等生物学过程中的作用。

材料与仪器

细胞或组织样品

RNaseAWAY 去核酸酶污染清洗液

磷酸盐缓冲液(PBS)

细胞裂解缓冲液(lysis buffer,含有 0.5% NP-40 和 0.5% Triton X-100)

1 M 甲醛溶液、1.2 M 甘氨酸、25% 甲醛溶液

5 M 甘氨酸溶液、10% Triton X-100 溶液

10% NP-40 溶液、10% SDS 溶液

蛋白酶抑制剂

RIPA 缓冲液(含有 1% NP-40、0.5% deoxycholate、0.1% SDS、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCI,pH 8.0)

1% TritonX-100 缓冲液(含有 1% Triton X-100、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCI, pH 7.4)

ProteinA+G Agarose

Phenol:Chloroform [pH 4.5]、无水乙醇

0.3 M 醋酸钠,15 mg/mL 线性丙烯酰胺

RNase-free 蛋白酶K (50 mg)

RNA 酶抑制剂

步骤

1. 收集细胞或组织样品。用 RNase AWAY 清洗液去除污染物,然后用 PBS 洗涤 2~3 次目的:准备细胞或组织样品,去除外部的污染物。

2. 加入细胞裂解缓冲液(提前加好蛋白酶抑制剂和 RNA 酶抑制剂,裂解液体积根据细胞量加)。4 ℃ 裂解 10~15 min,随后将细胞裂解液在 4 ℃ 下 12000 rpm 离心 10 min。

目的:裂解细胞并去除细胞碎片和细胞核。

3. 用 1 M甲醛溶液进行交联。将细胞裂解液中的甲醛最终浓度调整为 0.1%。在室温下旋转混合 15 分钟。加入 1.2 M 甘氨酸溶液以停止交联反应。

目的:交联 RNA 和蛋白质。

4. 洗涤样品。用 PBS 洗涤细胞裂解液。

目的:去除未交联的甲醛。

5. 用 25% 甲醛溶液进行二次交联。将细胞裂解液中的甲醛最终浓度调整为 0.1%。在室温下旋转混合 15 分钟。加入 5 M 甘氨酸溶液以停止交联反应。

目的:加强 RNA 和蛋白质的交联。

6. 洗涤样品。用 PBS 洗涤细胞裂解液,以去除未交联的甲醛。

目的:去除未交联的甲醛。

7. 进行免疫沉淀。将 25% 乙酰化抗体加入至样品中,4 ℃ 下旋转混合过夜。再加入 ProteinA+G Agarose,并在 4 ℃ 下旋转混合 2 小时。用 PBS 洗涤免疫沉淀物。

8. 4 ℃,2500 rpm(约 1000 g)离心 5 分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉 Protein A+G Agarose。

9. 用 1% TritonX-100 缓冲液洗涤免疫沉淀物后,再用 RIPA 缓冲液洗涤免疫沉淀物,洗涤五次。

目的:去除非特异性结合的 RNA 和蛋白质。

10. 洗涤完后用 RNase-free 蛋白酶K(100 μl 体系)在 37 ℃ 消化 1 h。

目的:完全去除非特异性结合的蛋白质,同时将 Protein A+G Agarose 上结合的 RNA 洗涤下来。

11. 加入等量的 Phenol:Chloroform [pH 4.5],混匀后 4 ℃ 离心 13000 rpm 15 min。

12. 取上清,加入三倍体积无水乙醇、0.3 M 醋酸钠和 15 mg/mL 线性丙烯酰胺沉淀过夜。第二天抽取乙酰化 RNA 进行下一步的测序或者 RT-qPCR。

注意事项

1. 对于不同细胞类型和不同生长状态的细胞,RNA-抗体复合物的制备可能存在差异,需要进行优化;

2. RNA-抗体复合物的富集和纯化过程中需要进行多次洗涤,以去除非特异性结合的 RNA 和蛋白质,洗涤的缓冲液需要严格控制 pH 和离子浓度,以保证 RNA-抗体复合物的稳定性和特异性;

3. 选择合适的抗体对 RNA 进行富集,需要进行对照实验,排除非特异性结合的干扰;

4. 在 A-RIP 实验中需要使用无乙酰化 RNA 的对照组进行比较,以减少假阳性结果的误差。

5. 所有实验都最好在 4 ℃ 或者冰上进行,所有试剂都需要加 RNA 酶抑制剂防止 RNA 降解。


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最后编辑于 2023-06-09 · 浏览 621

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