Klotho在盐敏感性高血压肾损伤中的作用及分子机制研究

盐为高血压的重要易患因素，血压的盐敏感性是指在高盐摄入时血压呈现的一种升高反应，与此相关联的高血压类型称为盐敏感性高血压（salt-sensitive hypertension，SSH）［1］。调查显示，51%的高血压人群具有盐敏感性，并且SSH占我国高血压人群的50%~60%［2］。此外，相较于原发性高血压，SSH患者血管、心脏、肾脏等损伤的发生率更高，损伤程度更严重［3］。其中，SSH肾损伤是长期高盐负荷与血压控制不佳所致的共同结局，会迁延发展至慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD），甚至为终末期肾病。Klotho作为一种抗衰老基因［4］，主要在肾脏中表达，其编码的分泌型蛋白（klotho蛋白）可以激素样形式进入血液循环中并发挥积极效应。研究发现，任何形式的肾损伤均会导致klotho表达下降，klotho缺乏出现于CKD的任意阶段，同时也会加速CKD的进展［5］。目前，klotho已作为一种评估CKD患者病情及预后的新型标志物，并在CKD治疗中发挥重要作用［6-7］。然而，迄今为止，klotho在SSH肾损伤中的作用及分子机制研究鲜见报道。因此，本实验采用NaCl 137 mmol/L和血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）10-6 mmol/L共同诱导的HBZY1细胞损伤模型模拟SSH肾损伤，通过观察klotho对HBZY1细胞活性及相关指标的影响，阐明klotho在SSH肾损伤中的作用及分子机制，对高血压的管理和心血管疾病的预防意义重大。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1　实验细胞　大鼠肾小球系膜细胞株HBZY1（Procell，货号：CL-0092）。

1.1.2　实验试剂　实验所用主要试剂包括：Opti-MEM®，TRIzol Reagent（康为世纪，货号：CW0580S）；Ultrapure RNA 超纯RNA提取试剂盒（康为世纪，货号：CW0581M）；HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme，货号：R223-01）；2×SYBR Green PCR Master Mix（Lifeint，货号：A4004M）；Reactive Oxygen Species Assay Kit（凯基生物，货号：KGT010-1100assays）；超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（酶免，货号：MM-0386R2）；丙二醛（MDA）试剂盒（酶免，货号：MM-0385R2）；超敏发光液（赛默飞，货号：RJ239676）；PVDF膜（Millipore，货号：IPVH00010）；内参一抗：Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（中杉金桥，货号：TA-08，1/2 000）；二抗：辣根酶标记山羊抗鼠IgG（H+L）（中杉金桥，货号：ZB-2305）；目的一抗：Rabbit Anti klotho（Santa Cruz，货号：sc-515942，1/1 000）；目的一抗：Rabbit Anti AT1R（Proteintech，货号：25343-1-AP，1/1 000）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（MDL，货号：MD913053）；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）预制胶套装试剂盒（MDL，货号：MD911919）；RNase Free ddH20（湖南艾特捷生物科技有限公司，货号：RO1012）；β-actin（Affinity，货号：AF7018）；辣根过氧化物酶（HRP）（北京索莱宝科技有限公司，货号：P8020）；磷酸缓冲盐溶液（PBS）（BioVision，货号：2128-1000）；lipofectamine 3000（赛默飞，货号：L3000015）；P3000（Qiagen，货号：9013150）；RIPA裂解缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司，货号：C1055）。

1.1.3　实验仪器　荧光PCR仪〔伯乐生命医学产品（上海）有限公司，货号：CFX Connect™实时〕；超高灵敏度化学发光成像系统〔伯乐生命医学产品（上海）有限公司，货号：Chemi DocTM XRS+〕；全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司，货号：Tanon-5200）；NovoCyte™流式细胞仪〔艾森生物（杭州）有限公司，货号：NovoCyte2060R〕；全自动酶标仪（六一，货号：WD-2102B）。

1.2　实验方法

1.2.1　细胞造模及分组　于2021年6月—2022年1月选取大鼠肾小球系膜细胞株HBZY1为实验细胞。首先，将实验细胞分为对照组与造模组，其中对照组正常培养，造模组给予NaCl 137 mmol/L和AngⅡ 10-6 mmol/L刺激24 h建立SSH肾损伤细胞模型，收集细胞，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）与蛋白质印记法（Western Blot）检测klotho mRNA和蛋白表达的差异。其次，为了验证klotho的肾脏保护作用及其相关机制，构建klotho干扰载体和过表达载体与血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）过表达载体。Klotho干扰实验分为5组，包括对照组、空载组、klotho-siRNA1组、klotho-siRNA2组、klotho-siRNA3组，其中，空载组转染空白质粒，klotho-siRNA1组、klotho-siRNA2组、klotho-siRNA3组分别转染含有相应序列的siRNA质粒载体；klotho过表达实验分为3组，包括对照组、空载组、klotho过表达组，其中，空载组转染空白质粒载体，klotho过表达组转染含有klotho基因的重组质粒；AT1R过表达实验分为3组，包括对照组、空载组、AT1R过表达组，其中，空载组转染空白质粒载体，AT1R过表达组转染含有AT1R基因的重组质粒。将构建的载体转染至细胞中并验证转染效率。转染成功后将实验分两部分进行，第一部分实验验证klotho的肾脏保护作用，实验分为4组，包括对照组、造模组、klotho过表达组与klotho干扰组，第二部分实验探索klotho的肾脏保护作用是否与AT1R相关，实验分为3组，包括造模组、klotho过表达组、klotho+AT1R过表达组。采用细胞计数试剂8（CCK-8）法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞活性氧（ROS）水平，ELISA法检测细胞上清液中MDA与SOD水平，免疫共沉淀（Co-IP）检测klotho与AT1R相互作用的影响。

1.2.2　细胞转染　当细胞密度为70％时，更换培养基；取2个灭菌EP管，每管加125 μL Opti-MEM®，其中一管加入5 μL lipofectamine 3000，另一管加入2.5 μg质粒、5 μL P3000，混匀后室温孵育5 min；将上述两个EP管混匀，室温孵育15 min，将混合液滴到六孔板中对应的孔内，将细胞放回孵箱培养；转染4 h后在六孔板中加入血清水平为20%的完全培养基1 mL；48 h后进行后续处理。

1.2.3　CCK-8法　将转染后的细胞消化、重悬，计数，铺板，细胞密度为7 000个/孔；待细胞贴壁后，24 h后将待测的96孔板细胞换成相同的培养基，每孔100 μL；每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱中孵育2 h；酶标仪在450 nm波长处检测每孔的吸光度（OD）值。

1.2.4　流式细胞术　按照1∶1 000用无血清培养基稀释活性氧荧光探针（DCFH-DA），最终浓度为10 μmol/L；弃去细胞培养液，向细胞中加入稀释后的DCFH-DA，37℃培养箱孵育20 min；用无血清的培养液洗涤3次，以充分去除多余的未进入细胞的DCFH-DA；加1 mL PBS洗涤，1 500 r/min离心5 min，弃上清液；加300 μL PBS重悬细胞后上机。

1.2.5　ELISA法　从室温平衡60 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；样本孔中加入待测样本50 μL；空白孔不加。标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.2.6　qRT-PCR　TRIzol使样本充分裂解，提取RNA进行浓度、纯度测定，将RNA通过逆转录HiFiScript cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在荧光定量PCR仪上进行检测，以β-actin为内参，计算出各组细胞中mRNA的相对表达水平。其中反应体系包括：2×SYBR Green PCR Master Mix（10 μL）、cDNA（1 μL）、上游引物（0.4 μL）、下游引物（0.4 μL）、RNase Free ddH20（8.2 μL）。klotho引物上游5'

-ACTTTCTTCTGCCCTATTTCACG-3'、下游5'-CCAGGTAATCGTTGTATTTTATCGG-3'，β-actin引物上游5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'、下游5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。

1.2.7　Western Blot　细胞加入裂解液，冰上放置15 min，12 000 r/min高速离心机离心10 min，取上清液，加入缓冲溶液，煮沸5 min，-20℃保存。用BCA蛋白质定量试剂盒检测细胞上清液中蛋白浓度，绘制标准曲线。制作SDS-PAGE胶，上样，开始跑胶，电泳60 V压缩蛋白，80 V分离蛋白（120 min），切好含有内参或目的条带的胶。依次放好海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵。用预冷的1×转膜液浸没目的胶带复合物，用300 mA恒流转膜。用1×TBST配置3%的脱脂牛奶封闭液，封闭1 h。将PVDF膜孵育一抗过夜。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后弃掉，重复3次。将PVDF膜孵育二抗2 h。洗膜，用1×TBST浸泡10 min后弃掉，重复3次。用发光液浸湿PVDF膜后放置于超高灵敏度化学发光成像系统样品放置区运行程序显影成像。

1.2.8　Co-IP　RIPA裂解缓冲液裂解细胞后，BCA法测定蛋白浓度，取等量的蛋白首先用IgG和A/G蛋白交联琼脂糖胶粒预处理，然后用klotho抗体与琼脂糖胶粒孵育，最后取等量蛋白行凝胶电泳、转膜后再用相应的抗体进行检测。

1.3　统计学方法　数据分析及实验作图均采用GraphPad Prism 8.0软件进行。各项实验至少进行3次独立平行实验，结果均以（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　NaCl和AngⅡ处理对HBZY1细胞中klotho mRNA和蛋白的影响　与对照组相比，造模组中klotho的mRNA水平与蛋白表达均下降，差异有统计学意义（t=7.102、7.506，P=0.002、0.002），见图1。

2.2　Klotho干扰和过表达与AT1R过表达验证结果　对照组、空载组、klotho-siRNA1组、klotho-siRNA2组、klotho-siRNA3组间蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=23.13，P<0.001）；与对照组相比，三条klotho干扰序列均具有干扰效果，其中klotho-siRNA2干扰效果最好，差异有统计学意义（P<0.001），见图2。对照组、空载组、klotho过表达组间蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=414.80，P<0.001）；与对照组相比，klotho过表达组的klotho蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.001），见图3。对照组、空载组、AT1R过表达组间蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=53.97，P<0.001）；与对照组相比，AT1R过表达组的AT1R蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.001），见图4。

2.3　Klotho对细胞活力的影响　对照组、造模组、klotho过表达组、klotho干扰组间细胞活力比较，差异有统计学意义（F=537.60，P<0.001）；与对照组相比，造模组细胞活力下降，差异有统计学意义（P<0.001）；与造模组相比，klotho过表达组细胞活力升高，klotho干扰组细胞活力下降，差异有统计学意义（P<0.001），见图5。

2.4　Klotho对细胞氧化应激损伤的影响　对照组、造模组、klotho过表达组、klotho干扰组间ROS、MDA，SOD水平比较，差异有统计学意义（F=1 677.00、54.33、47.15，P<0.001）。与对照组相比，造模组细胞内ROS、MDA水平升高，SOD水平下降，差异有统计学意义（P<0.001、P=0.004、P=0.041）。与造模组相比，klotho过表达组ROS、MDA水平下降，SOD水平上升（P<0.001、P=0.003、P=0.018）；而klotho干扰组ROS、MDA水平升高，SOD水平下降，差异有统计学意义（P<0.001、P=0.002、P=0.001），见图6。

2.5　Klotho通过AT1R对细胞活力的影响　造模组、klotho过表达组、klotho+AT1R过表达组间细胞活力比较，差异有统计学意义（F=335.50，P<0.001）；与造模组相比，klotho过表达组细胞活力升高，差异有统计学意义（P<0.001）；与klotho过表达组相比，klotho+AT1R过表达组细胞活力下降，差异有统计学意义（P<0.001），见图7。

2.6　Klotho通过AT1R对细胞氧化应激损伤的影响　造模组、klotho过表达组、klotho+AT1R过表达组间ROS、MDA，SOD水平比较，差异有统计学意义（F=7 815.00、26.77、22.54，P<0.001、P=0.001、P=0.002）。与造模组相比，klotho过表达组细胞ROS、MDA水平下降，SOD水平上升，差异有统计学意义（P<0.001、P=0.024、P=0.007）。与klotho过表达组相比，klotho+AT1R过表达组细胞ROS、MDA水平上升，SOD水平下降，差异有统计学意义（P<0.001、P=0.001、P=0.002），见图8。

2.7　Klotho与AT1R相互作用　免疫共沉淀实验证明，用klotho抗体下拉后能检测到AT1R的表达，表明klotho和AT1R之间确实存在相互作用，见图9。

3　讨论

1997年，KURO-O等［8］通过培育基因缺陷小鼠发现了一种抑制衰老的基因——klotho基因，该实验发现，klotho基因的缺失会引发一系列机体衰老退化的表现，如动脉钙化、骨质疏松、皮肤皱缩、生长迟缓、步态障碍、寿命缩短等。最初的动物实验发现klotho主要在肾脏中表达，肾脏klotho表达的消除使血液循环中klotho水平降低80%，这与人体研究中所得结论一致［9］。近年来，在各种肾损伤模型的研究中，包括阿霉素肾病模型、环孢霉素A肾病模型、多柔比星肾病模型、糖尿病肾病模型等均发现klotho表达下降［10］。本研究发现，与对照组相比，造模组klotho mRNA与蛋白表达均显著下降，提示在SSH肾损伤中存在klotho表达下降，这与上述研究结果一致。

Klotho参与机体多种病理生理反应，被认为是机体衰老进程中的重要调节因素。Klotho基因所编码的三种klotho蛋白α-klotho、β-klotho、γ-klotho蛋白均为膜结合性蛋白功能局限，主要是作为成纤维细胞生长因子的受体来发挥相应作用［11］。其中，α-klotho蛋白可在蛋白酶的作用下将胞外结构域进行剪切，所得产物称为可溶性klotho蛋白［12］。研究发现，可溶性klotho蛋白具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、调节钙磷代谢、调控血糖稳态等多种生物功能［13-14］。既往研究已证实klotho在肾损伤中的保护作用［15］。在腺嘌呤诱导的肾衰竭模型中，klotho-siRNA治疗加剧了肾纤维化的进展，同时导致假手术组小鼠中出现肾损伤，然而，外源性补充klotho逆转了上述现象［16］。不仅如此，HU等［17］发现，在肾脏缺血再灌注损伤诱导后给予klotho治疗可以减少α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）与Ⅰ型胶原蛋白（I collagen）表达，抑制肾脏纤维化，减轻肾损伤，提示即使在肾损伤发生后，klotho同样具有治疗潜力。本研究采用klotho-siRNA干扰与过表达手段来探讨klotho对HBZY1细胞活力的影响。发现与对照组相比，造模组细胞活力下降。与造模组相比，klotho过表达组细胞活力升高，而klotho干扰组细胞活力进一步下降，提示klotho对肾脏细胞具有保护作用。KIMURA等［18］发现，过表达klotho的小鼠肾组织中ROS水平低，过氧化氢、SOD等抗氧化酶活性高，而klotho缺陷小鼠ROS水平高，抗氧化酶活性低，表明klotho基因具有较强的抗氧化活性。本研究亦发现，与对照组相比，造模组细胞内ROS、MDA水平升高，SOD水平下降。与造模组相比，klotho过表达组ROS、MDA水平下降，SOD水平升高，而klotho干扰组细胞内ROS、MDA水平进一步升高，SOD活性进一步下降。提示在HBZY1细胞中，klotho可通过抑制氧化应激损伤来发挥保护作用。

AngⅡ是氧化应激和ROS介导的信号传导的有效中介，AngⅡ通过激活AT1R诱导ROS的产生。在高血压小鼠心肌纤维化中，通过阻断AT1R可明显抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞ROS生成和胶原表达［19］。此外，在AngⅡ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大的研究中，klotho可显著抑制心肌细胞肥大，进一步研究表明，klotho预处理显著下调AT1R蛋白表达，而不影响血管紧张素Ⅱ2型受体蛋白表达［20］。本研究中，与造模组相比，klotho干预后ROS、MDA水平下降，SOD水平升高，细胞活力升高，而AT1R过表达后逆转了上述现象。不仅如此，Co-IP实验确定klotho与AT1R之间存在相互作用。提示klotho通过与AT1R受体相互作用，抑制氧化应激损伤，从而发挥细胞保护作用。

综上所述，本研究从细胞水平验证了klotho在SSH肾损伤中的保护作用，并从蛋白质与蛋白质相互作用的角度，证明klotho通过与AT1R相互作用，抑制氧化应激损伤，从而发挥保护作用。后续计划在细胞实验中进一步探索klotho与AT1R之间的具体作用位点，并在动物实验中探讨klotho对SSH肾损伤的保护作用机制，为临床应用及药物研发提供更加充分的理论依据。

本文无利益冲突。

参考文献略

本文来源：赵伟，唐荣杰，杨珊珊，等. Klotho在盐敏感性高血压肾损伤中的作用及分子机制研究［J］. 中国全科医学，2023，26（24）：3042-3049. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0010.