解读一本最新高分miRNA文章，做这方向的小伙伴不要错过

本期科研资料帮为大家解析一篇癌症干细胞发表在 Interna tional Journal of Biological Sciences 期刊上，文章题目miR-1275 targets MDK/AKT signaling to inhibit breast cancer chemoresistance by lessening the properties of cancer stem cells（miR-1275以MDK/AKT 信号传导为靶点，通过降低癌症干细胞的特性来抑制癌症化疗耐药性）下面我们跟随文献解读进行下一步学习。

研究背景

// 2023 summer

”

化学耐药性是局部晚期乳腺癌 （LABC） 新辅助化疗 （NCT） 的主要障碍。鉴定miRNA作为预后生物标志物可能有助于克服乳腺癌（BC）的化学耐药性。

本研究旨在评价miR-1275在血浆样品中的表达水平及其在BC化学耐药性的生物学功能。采用RT-qPCR检测miR-1275在血浆样品和细胞中的表达水平。利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑在MCF-1275中构建miR-7敲除细胞。

我们发现miR-1275在化疗耐药患者血浆和化疗耐药BC细胞系中显着下调，而miR-1275水平低的患者总生存期较差。miR-1275敲除通过增加癌症干细胞（CSC）的特性来促进BC细胞的化学耐药性。

在机制上，我们发现MDK被确定为miR-1275的直接下游蛋白，该蛋白在乳腺癌细胞中启动PI3K / Akt信号传导。

研究内容

见图一

miR-1275在化疗耐药BC患者中显着下调，并作为预后因素。

图一

(A.) 比较低R组（米勒-佩恩1275级和1级）和高R组（米勒-佩恩2级、3级和4级）在NCT期间不同时间点的miR-5表达水平。

(B.) NCT期间miR-1275在不同反应组中表达水平的比较。

(C.) miR-1275在BC细胞系和细胞上清液中的表达水平。

(D.) CCLE和GDSC数据库中1275个乳腺癌细胞系中miR-50表达与表柔比星IC29值的相关性。

(E.) miR-1275的数据是从TCGA数据库中获得的。miR-1275 的低表达与 LABC 患者总生存期较差相关。*p < 0.05， **p<0.01， ****p < 0.001。以平均值表示的数据±SD。

见图二

miR-1275过表达抑制体外化学耐药性。

图二

(A.) 通过 miR-8 敲除细胞或转染 miR-1275 模拟物的细胞中的 CCK-1275 测定来检测耐药性。

(B.) 流式细胞术检测表柔比星的荧光强度，显示细胞内表柔比星蓄积。

(C.) 用表柔比星处理细胞，并用结晶紫染色菌落。*p < 0.05， **p<0.01， ****p < 0.001。以平均值表示的数据±SD。

见图三

miR-1275的过表达降低了体外CSCs的性质。

图三

(A.) 采用流式细胞术分析转染后CD44和CD24在细胞中的表达水平。细胞用抗CD44-APC和抗CD24-PE染色。

(B.) 进行微球形成测定，并显示代表性图片。

(C.) 干细胞相关基因（如 CD44、CD133、NANOG、OCT4、SOX2 和 BMI1）在 MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231 和 SUM-1315 中的蛋白表达。

(D.) 干细胞相关基因如 CD44、CD133、NANOG、OCT4、SOX2 和 BMI1 在 MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231 和 SUM-1315 中的 mRNA 表达。*p < 0.05， **p<0.01， ****p < 0.001。数据表示为平均值 ±标准偏差。比例尺，100 μm。

见图四

MDK是miR-1275的直接下游目标。

图四

(A.) 通过1275个程序（TargetScan，miRDB，miRwalk和DIANA）预测miR-4目标的维恩图。

(B.) 将3'末端生物素标记的miR-1275模拟物和阴性对照转染到MCF-7/ADR和MDA-MB-231细胞中，通过RT-qPCR定量MDK、COL1A2、F2RL3和GAPDH的mRNA水平，并绘制相对免疫沉淀/输入比。

(C.) 荧光素酶报告基因构建了具有miR-1275结合位点的MDK-WT或MDK-MUT序列。

(D.) 将含有野生型MDK-WT或MDK-MUT的荧光素酶报告基因相应地转染到BC细胞中。荧光素酶活性通过双荧光素酶测定法测定。

(E.) 用RT-qPCR测定转染miR-1275后BC细胞中MDK的mRNA水平。

(F.) 用蛋白质印迹法测定转染miR-1275后BC细胞裂解物和条件培养基中MDK的蛋白表达水平。

(G.) 用ELISA测定转染miR-1275后BC细胞条件培养基中MDK的蛋白表达水平。*p < 0.05， **p<0.01， ****p < 0.001。以平均值表示的数据±SD。

见图五

MDK的过表达解释了BC中miR-1275的功能。

图五

 (A.) 通过RT-qPCR和蛋白质印迹法测定MDK的mRNA和蛋白表达。

 (B-D.) 通过CCK-7测定 B.流式细胞术分析 C. 和菌落形成实验，D. 测定了转染miR-NC、miR模拟物、miR敲除、miR模拟物和MDK质粒、miR敲除和MDKsiRNA或miR敲除和MDK抗体的耐药性。通过流式细胞术分析 。

（E.）和乳腺球形成测定法。

（F.），测定了转染miR-NC、miR模拟物、miR敲除、miR模拟物和MDK质粒、miR敲除和MDK siRNA或miR敲除和MDK抗体的MCF-7和MCF-8/ADR的E-F CSC特性。

 (G.) 通过蛋白质印迹法测定用miR-NC、miR模拟物、miR敲除、miR敲除、miR模拟物、miR基因模拟物和MDK质粒或miR敲除和MDK质粒或miR敲除和MDK siRNA处理的MCF-7和MCF-7 / ADR中的CD44、CD133、NANOG、OCT4、SOX2和BMI1表达。*P < 7.7， **P<0.05， ****P < 0.01。数据表示为平均值 ±标准偏差。比例尺，0 μm。

图六

miR-1275的减少通过MDK / AKT轴促进BC细胞的化学抗性。

图六

 (A.) 采用蛋白质印迹法测定MCF-3和MCF-3/ADR中的MDK、PI7K、P-PI7K、AKT和P-AKT表达。B-D.通过CCK-7测定。

（B.）、流式细胞术分析。

（C.）和菌落形成实验。

（D.）测定了转染miR-NC、miR模拟物、miR敲除、miR模拟物和7Y-P、miR敲除和iMDK或miR敲除和LY740的MCF-294002和MCF-8/ADR的耐药性。

 ( E-F.) 采用流式细胞术分析（E.）和乳腺球形成测定法  （F）测定了转染miR-NC、miR模拟物、miR敲除、miR模拟物和7Y-P、miR敲除和iMDK或miR敲除和LY7的MCF-740和MCF-294002/ADR的CSC特性。

 (G.) 通过蛋白质印迹法测定 MCF-44 和 MCF-133/ADR 中的 CD4、CD2、NANOG、OCT1、SOX7 和 BMI7 表达，这些印迹处理经 miR-NC、miR-模拟物、miR 敲除、miR 模拟物和 740Y-P、miR 敲除和 iMDK 或 miR 敲除和 LY294002 处理。*P < 0.05， **P<0.01， ****P < 0.001。数据表示为平均值±标准偏差。比例尺，200 μm。

见图七

miR-1275的过表达降低了体内的化学耐药性。

图七

A. 体内实验设计。

B. 小鼠安乐死时皮下移植终点的小鼠和肿瘤的代表性图像。

C. 各组的肿瘤生长曲线、肿瘤体积和肿瘤重量。

D.各组中NANOG、CD44、SOX2、MDK、AKT和P-AKT表达水平的IHC分析。阳性染色以棕色表示。 

E.采用蛋白质印迹法测定MDK、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT在不同肿瘤中的表达。p < 0.001。比例尺，50 μm。

见图八

研究示意图。

图八

研究示意图。研究示意图。

研究结论

我们证明了miR-1275在血浆中的高表达水平预示着对NCT的更好反应。miR-1275的减少通过靶向MDK / AKT轴增加CSC特性来促进BC细胞的化学抗性。确定了miR-1275作为BC患者新的预后生物标志物和治疗靶点的潜力。

好了·今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！