大鼠关节软骨细胞分离提取

大家好，我是老张知行家。

篇帖子我会极尽详细的写下自己半年多苦心摸索出的绝对有效，提取率极高的大鼠关节软骨细胞的分离提取步骤。

1，选材

 选2-3周龄的SD大鼠，一般3周大的鼠体重在50g左右，根据我的经验，大鼠体重在30g左右—40g是提取成功率高的保障，低于30g的大鼠体型小，不太好脱颈处死，当然大鼠周龄越小，提取率越高。

2、获取软骨（髋关节软骨）

髋关节软骨组织，量大，膝关节软骨太少了，操作比较费精力，不划算，当然，耐心的小伙伴也可以试试。大鼠脱颈处死，解剖的具体操作步骤不放图了，估计审核也不会通过，后面会放个全流程的操作视频，但细节只会在文字里提及。

注意要点：

a,全程必须控制获取的大鼠软骨不被污染了，很重要，一旦发生细菌污染，几无可能去除细菌，前功尽弃。（就是刀片要勤换，一只大鼠两个刀片，一个用于切开皮毛，一个用于分离肌肉组织，获取软骨，无菌垫布也是，一张垫布处理两只大鼠，分别用上下端，别图方便用手拿软骨，用刀片挑，用镊子夹可）

b,我一般在晚上实验室细胞房没人做实验了，处理大鼠，获取软骨后夜深了来不及接着消化，放在装有1ml PBS（含双抗的PBS）的冻存管或EP管，放在4℃冰箱第二天提，不要低温冻存，软骨最好现提现消化，冻存对软骨影响极大，不要图方便或几天都没时间处理就冻存了，软骨鲜活状态分离效果最佳，冻存后基本上分离不出细胞了，顶多也就分理出个位数的细胞，但鲜活状态的，可以分离出上百万个细胞（每次提取按两只大鼠的量）

3，分离消化软骨

a,准备相应试剂

1.  大鼠软骨细胞完全培养基
2. 胶原酶Ⅱ
3. 0.25%的无菌胰蛋白酶
4. 含双抗的PBS
5. 上述产品都是大众化的，随便公司买都行，进口的还是国产的都可

b,用刀片切割软骨，剪刀不行，除非像刀片一样的剪刀头，一般手术剪刀剪软骨剪不了那么细，对的，切割软骨要尽可能的细碎，这是关键。一般方法所言1立方毫米的不太现实，1立方毫米大概是方便描述用语，我们的实验条件简陋，没人家专业，1立方毫米对他们可能行，不适合我们，细碎到用5ml的枪头能吸进去。（注意刀片，手无菌，手不要碰到软骨）

c,剪切好软骨后，用含双抗的PBS反复冲洗两次后1000g,2分钟短暂离心到底部，加3ml样子的0.25%的无菌胰酶放置37℃培养箱30分钟，期间大概10分钟摇晃一次或二指弹，让软骨组织散开，但至少摇晃一次，不必要用移液器吸冲，减少污染概率。（确保胰酶无菌，含双抗的PBS无菌，不放心可以除菌过滤）

d,培养箱30分钟后，加5ml样子的完全培养基终止消化，1000g,5分钟离心到底部，不要偷懒，溶液里面可能已经有被消化下来的细胞了。后弃上清加4ml的用完全培养基配置的0.2%的二型胶原酶溶液，放置37℃静置3小时，不要摇床，静置即可，大概两小时后可以简单的摇晃下或二指弹，让软骨组织散开，接着消化。（用于消化的二型胶原酶溶液必须无菌，配置好后，用0.22um的除菌滤器过滤下，防细菌污染贯穿始终，上述c、d 步骤中提到的软骨消化过程，我一般在15ml无菌离心管里操作）（对了，后面用的培养瓶或培养皿要用多聚赖氨酸溶液提前包被3小时，便于细胞贴壁）

e,唉，罗嗦了这么久，终于到了见证成果的时候了，3小时消化结束后，可能会有些未被消化的组织，没事，不要在意，剩下的可能是一些软骨基质，聚糖之类的，当然也可以后面接着消化，现在要做的是加5ml完全培养基终止消化，300g,5分钟离心。离心后，弃上清加1ml左右的完全培养基悬浮细胞，接种到包被过的培养瓶里，2-3天后换液。

f,在d步骤中提到的培养瓶包被，是用多聚赖氨酸：PBS=1：9配置的包被液，一般包被液用量覆盖住瓶底部即可，包被结束后，用PBS冲洗两次，再用完全培养基润一下就可以培养我们得到的细胞啦，为啥要冲洗呢，因为多聚赖氨酸有一定毒性。

4，成果展示

刚分离出的细胞，呈椭圆状，第0天

培养一天后，细胞已经贴壁了，第1天

这是P2代细胞了应该，忘记第哪天了

我写这边帖子之前仍然没有像样的方法论+实操的帖子，我算抛砖引玉吧，各位也可以把自己提取其他细胞的方法论在评论区分享出来。