快报 | xMAP微球技术用于结核分枝杆菌gyrA突变鉴定研究

作者：欧喜超，赵冰，宋泽萱，裴少君，王胜芬，贺文从，刘春法，刘东鑫，邢睿达，夏辉，赵雁林

第一作者及单位：欧喜超，中国疾控中心结核病预防控制中心；赵冰，中国疾控中心结核病预防控制中心

通信作者及单位：赵雁林，中国疾控中心结核病预防控制中心

Evaluation of Microsphere-based xMAP Test for gyrA Mutation Identification in Mycobacterium Tuberculosis

Ou Xichao, ZHAO Bing, Song Zexuan, Pei Shaojun, Wang Shengfen, He Wencong, Liu Chunfa, Liu Dongxin, Xing Ruida, Xia hui, Zhao Yanlin

Biomed Environ Sci, 2023, 36(4): 384-387.

doi: 10.3967/bes2023.046.

PMID: 37105915

背景

耐药结核病（DR-TB）逐渐成为日益严重的公共卫生威胁之一。氟喹诺酮类抗生素（FQ）长期以来被用作抗结核药物，其广泛使用导致结核分枝杆菌（MTB）临床分离株产生耐药性。此外，世界卫生组织（WHO）关于广泛耐药结核病（extensive drug-resistant tuberculosis, XDR-TB）和准广泛耐药结核病（pre-XDR-TB）的新定义分别为：XDR-TB是指符合耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB）或利福平耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis, RR-TB）定义，同时对任意FQ及至少1种其他A组药品（贝达喹啉、利奈唑胺）耐药的MTB菌株引起的结核病。pre-XDR-TB是指符合MDR/RR-TB定义，同时对任意FQ耐药的MTB菌株引起的结核病。因此，检测FQ耐药性对于XDR-TB和pre-XDR-TB患者的准确诊断和治疗具有十分重要的意义。

传统基于培养的表型药物敏感性试验（简称“药敏试验”）耗时长且操作复杂，无法提供及时准确的诊断结果用于患者治疗和管理。抗结核药物耐药主要是药物作用靶标基因或参与药物活化的基因发生突变所致，FQ主要通过作用于结核分枝杆菌DNA旋转酶（DNA gyrase，II型拓扑异构酶）来抑制其复制和转录。MTB对FQ耐药的决定区位于gyrA和gyrB，分别编码DNA旋转酶的A亚基和B亚基。MTB对FQ的耐药主要通过gyrA突变介导，gyrA基因的D94G、A90V、D94A、D94N、S91P、D94Y、D94H和G88C被WHO发布的MTB突变目录列为第1组突变位点（与FQ耐药相关）。

基于微球的Luminex高通量多重检测（xMAP）平台最多可以在单个反应管中分析多达500个不同的检测靶标。通过针对不同待测物靶标基因设计寡核苷酸探针，以共价偶联的方式结合到特定的编码微球上，每个编码微球对应相应的检测指标，能够在一次反应中同时捕获多种分析产物。xMAP集成多重PCR扩增和微球杂交技术，为高通量的耐药结核病诊断提供了一个崭新的平台。在本研究中，我们利用xMAP平台开发了一种基于微球的xMAP检测用于gyrA基因突变鉴定，通过参考WHO突变目录，合成了一系列引物来扩增gyrA基因中含有耐药突变的基因片段，结合野生型和突变型位点的检出情况，用于FQ耐药性预测。通过与表型药敏试验和全基因组测序结果比较，评价xMAP微球技术用于MTB gyrA突变鉴定的效能。

材料和方法

1. 结核分枝杆菌菌株传代培养：结核分枝杆菌临床分离株来自中国疾控中心国家结核病参比实验室，选取210株临床分离菌株，在罗氏固体培养基上传代培养3~4周。

2. 表型肉汤微孔板法药敏试验：使用Sensititre^® MYCOTB plate进行微孔板法药敏试验，同时对12种抗结核药物进行测试，包括氧氟沙星（Ofx）和莫西沙星（Mfx）。参考CLSI M24-A2，Ofx和Mfx的临床折点浓度分别为2.0和0.5 μg/ml。

3. xMAP检测：从罗氏固体培养基表面挑取1环分离培养物，悬浮在500 μl TE缓冲液中，100 ℃煮沸15 min后，12000×g离心5 min，将含有核酸模板的200 μl上清液转移到新的离心管中进行xMAP检测[海仕兰（上海）生物科技有限公司]。16S和λ噬菌体用于整个检测过程的质量控制，包括核酸提取、多重PCR扩增和杂交。xMAP可检测4个耐药相关基因突变位点的8个特定突变位点类型（表1）。

表1 xMAP检测氟喹诺酮类药物耐药突变位点类型

4.全基因组测序（WGS）：利用Illumina HiSeq 2000平台对CTAB法提取的结核分枝杆菌基因组DNA进行WGS检测。采用WHO推荐的Clockwork分析流程对所有原始WGS数据进行分析，检测到Group 1（与耐药相关）和Group 2（暂时与耐药相关）耐药相关突变的菌株被定义为基因型耐药，未检测到相关基因突变的菌株被定义为基因型敏感。

5.统计学处理：与表型药敏试验和WGS检测结果对比，评价xMAP用于Ofx和Mfx耐药性预测的检测效能。

结果

采用xMAP、表型微孔板法和WGS对210株临床分离MTB菌株进行Ofx和Mfx药敏试验。210株临床分离株中，谱系2占71.4%（150/210），谱系4占28.6%（60/210），见图1。根据微孔板法药敏试验结果，耐多药50株、单耐异烟肼（INH） 39株、单耐利福平（RFP）15株，INH和RFP均敏感106株，Ofx耐药41株（19.5%），Mfx耐药43株（20.5%）。WGS结果显示，42株分离株在gyrA基因中有46个可检测的突变，最常见的耐药突变为D94G（34.8%，16/46），其次为A90V（15.2%，7/46）、S91P（10.9%，5/46）、D94Y（8.7%，4/46）、D94N（8.7%，4/46）、D94A（8.7%，4/46）、D94H（4.3%， 2/46）和 D90N（4.3%， 2/46）。gyrA基因中检测到1个A288D突变，gyrB基因中检测到1个N449K突变，在4株（9.5%，4/42）分离株中检测到2个突变（图1）。

图1 结核分枝杆菌分离株谱系构成、表型耐药和基因型耐药谱

与表型肉汤微孔板法药敏试验相比，xMAP检测Ofx和Mfx耐药性的周转时间明显缩短，从10~21 d缩短至仅5 h。xMAP检测Ofx耐药的敏感度（95%CI）和特异度（95%CI）分别为90.2%（76.9%~97.3%）和98.8% （95.8%~99.9%），检测Mfx耐药的敏感度（95%CI）和特异度（95%CI）分别为88.4%（74.9%~96.1%）和99.4%（96.7%~100.0%） ，见表2。

表2  与表型药敏试验相比，xMAP检测Ofx和Mfx耐药性的检测效能

在41株Ofx表型耐药菌株中，4株经xMAP鉴定为敏感，1株经WGS检测发现gyrA D89N突变，该突变在WHO突变目录中被列到第3组（耐药不确定），该分离株对Ofx和Mfx的MIC分别为8 μg/ml和4 μg/ml，也提示对Mfx耐药。另一株对Ofx敏感但对Mfx耐药菌株也检测到gyrA D89N突变，该菌株对Ofx和Mfx的MIC均为2 μg/ml。gyrA D89N作为一种罕见突变，其与FQ耐药的关系尚不完全清楚。另外3株Ofx表型耐药xMAP敏感菌株的MIC分别为4、4和8 μg/ml，可能由于异质性耐药或未知耐药基因突变引起Ofx耐药有关。2株表型敏感xMAP耐药的分离株中，通过WGS检测到gyrA D94T和D94N突变，2株菌株的MIC均为2 μg/ml，等同于Ofx临床折点浓度，可能由于表型药敏试验操作误差或未知补偿性突变恢复了其对Ofx的敏感性。

5株Mfx表型耐药但xMAP敏感的菌株，WGS结果显示，2株未携带任何gyrA和gyrB突变，可能由于未知耐药机制或异质性耐药所致；2株含有上面提及的gyrA_D89N突变；1株含有gyrB_N499K突变（WHO突变目录为第3组）；Mfx的MIC均为1 μg/ml（低水平耐药）。1株Mfx表型敏感但xMAP耐药的菌株，通过WGS检测发现gyrA D94N突变，Mfx的MIC为0.25 μg/ml，接近Mfx的临床折点浓度。

与WGS结果比较，检测到WHO突变目录第一组和第二组耐药相关突变的菌株被定义为基因型耐药，210株临床分离株中，xMAP检测Ofx和Mfx耐药的敏感度和特异度均为100.0%。

结论

xMAP检测在识别MTB gyrA突变方面表现出良好的效能，随着WHO突变目录的不断更新，在其开放式检测平台基础上，通过加入更多优化设计的引物和探针，将可以更准确地诊断MTB对FQ和其他抗结核药物的耐药性。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号