脱细胞基质水凝胶在再生医学中的研究进展

引言

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是分布于细胞外空间的蛋白及多糖形成的网状结构，主要成分包括胶原、弹性纤维、蛋白聚糖和糖蛋白等。ECM 独特的网状结构不仅赋予了组织和器官特定的机械性能，同时也为细胞生长提供了必要的生存场所，并调控细胞的增殖、分化、迁移等生命活动[1]。

虽然自体移植一直被认为是移植手术中的金标准，但供体来源不足及二次创伤等原因都限制了它的广泛应用。研究不同组织 ECM 的组成和功能，以及模仿并构建具有高仿生性的生物支架已成为组织工程领域的研究热点[2-5]。脱细胞后的天然 ECM 支架不仅保留了组织的微环境，而且表现出优异的生物学活性，已被广泛用作再生医学的支架材料。通过各种脱细胞技术获得的支架形式主要包括二维（two-dimensional，2D）片状支架、三维（three-dimensional，3D）海绵支架和水凝胶支架，其中水凝胶支架表现出更好的均一性和可操作性，在临床上具有更广阔的应用前景[4-6]。

2008 年 Badylak 等首次报道猪膀胱脱细胞基质（decellularized extracellular matrix，dECM）水凝胶的制备方法后，先后有研究将小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）[7]、心脏[8-12]、肝脏[13-14]、肾脏[15]、半月板[16]、胰腺[17-18]、子宫[19]、神经[20-21]、脂肪[22-23]等组织制备成 dECM 水凝胶。凝胶化的 dECM 具有适合细胞生长的三维空间结构、良好的生物相容性以及优异的可控流动性和可注射性，非常适合作为微创手术的植入物，实现组织的修复再生[24-29]。下面将从 dECM 水凝胶的制备和临床前应用两个方面对近 3～5 年相关领域的研究进展进行综述。

1  dECM 水凝胶的制备

1.1  脱细胞方法

组织脱细胞是制备 dECM 水凝胶的重要步骤，其主要目的是消除组织的免疫原性，并尽可能保留原有 ECM 组分。传统脱细胞的原理是运用物理学、化学和酶学等方法，破坏细胞及胞内结构，再漂洗去除细胞碎片保留 ECM。其中物理法主要包括剪碎、刮除、冻融、搅拌等；化学和酶学方法主要通过破坏细胞的膜相结构来破碎细胞。目前，常用的脱细胞试剂主要有三类：① 离子型表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate，SDC）等；② 非离子型表面活性剂，如曲拉通 X-100 等；③ 生物酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、DNA 酶、RNA 酶等[4]。

机械破碎结合脱细胞试剂已成为目前最常采用的脱细胞方法。Singelyn 等[10]将猪心脏组织剪碎，先后用 1% SDS 和 1% 曲拉通 X-100 对组织进行脱细胞处理，苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）后发现脱细胞后的心脏组织呈多孔网状结构，且未见细胞核残留。Baghalishahi 等[9]将大鼠心脏组织剪碎后置于 1% SDS 和 1% 曲拉通 X-100 中进行机械搅拌，HE 染色、Hoechst 染色结果均证实该脱细胞方法可将细胞核彻底去除，但纤连蛋白、层粘连蛋白等重要基质组分丢失严重。Prest 等[21]在处理犬类神经组织的过程中，先使用胰蛋白酶对细胞进行消化，随后用 3% 曲拉通 X-100 对细胞进行破坏，DAPI 染色结果显示经脱细胞处理后的神经组织 ECM 仅有少量细胞核残留，组织 DNA 含量由最初的（1 043.6 ± 291.2）ng/mg 降至（158.1 ± 34.5）ng/mg。Ahearne 等[30]将猪角膜反复冻融后，结合 DNA 酶和 RNA 酶对其进行脱细胞处理。Hoechst 染色未观察到细胞核残留，DNA 含量检测结果显示其残存含量为 15%，且组织原有空间结构保留较为完整。因此，相比化学试剂法，酶学法更为温和，对组织 ECM 的原有组分及空间结构破坏小，而机械破碎结合化学试剂法去除组织细胞成分的过程中，虽去除细胞成分的效果显著，但对基质破坏相对严重。

近年来，基于组织原有脉管系统的灌注冲洗已逐渐成为肝、肾等实质器官脱细胞的重要方法。研究显示此方法对组织的整体结构影响较小，在除去细胞成分的同时仍可保留组织的立体形态和血管结构。Wang 等[31]通过肝门静脉插管，使用 1% SDS、0.1% 氨水先后对大鼠肝脏进行灌注，直至肝脏透明。对剩余组织进行检测后发现，其 DNA 含量仅为原组织的 1.1%，且剩余组织中总蛋白、胶原蛋白、糖胺聚糖（glycosaminoglyca，GAG）等含量分别为原组织的 52%、71%、85%，均较大程度得到保留。除上述脱细胞方法外，Seo 等[8]还使用超临界二氧化碳将大鼠心脏组织脱细胞。实验人员将获得的大鼠心脏组织冷冻干燥后剪碎，放于装有二氧化碳液体的高压容器内，350 bar 压力下反应 6 h，然后用含有 DNA 酶的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗。结果显示，超临界二氧化碳组与化学试剂组的 DNA 残留并无显著差异，而前者胶原、GAG、胰岛素样生长因子结合蛋白-2、血管内皮生长因子等生长因子大部分得到保留，尤其是 GAG 含量在原组织［（7.0 ± 0.5）μg/mg］和实验组［（6.1 ± 0.4）μg/mg］中十分接近，但化学试剂组中其剩余含量仅为原组织的 14%，进一步突显了超临界二氧化碳法相比于其他脱细胞方法的优势。

1.2  dECM 凝胶化

dECM 水凝胶的形成是基于胶原自组装的一个过程，同时也受糖胺聚糖、蛋白聚糖和多种蛋白的影响。具体过程包括两个关键步骤：① 利用酶解、酸溶等方法溶解 dECM 制备成均相溶液；② 调整溶液温度、盐离子浓度及 pH，或加入交联剂诱导交联形成凝胶[4]。

1.2.1  dECM 的溶解

溶解 dECM 最常用的方法是通过胃蛋白酶的消化作用，使不溶性胶原蛋白聚合体在解螺旋后被切割成可溶的单体分子。Freytes 等[32]首次通过冻干、研磨、盐酸-胃蛋白酶溶液消化以及磁力搅拌等步骤制备了猪膀胱 dECM 溶液。Saheli 等[13]尝试用 0.5 mol/L 醋酸代替盐酸对肝脏 dECM 进行溶解，以减少强酸对蛋白、生长因子等活性物质的破坏。除不同酸溶液外，胃蛋白酶的浓度及作用时间也会影响 dECM 的溶解。此外，也可利用尿素对组织 dECM 进行溶解。Uriel 等[33]利用尿素对 dECM 中非共价键进行破坏，促进了 dECM 中各类组分的溶解，然后离心去除残留的非可溶性成分，得到均相的 dECM 溶液。

1.2.2  dECM 溶液成胶

通过改变 dECM 溶液的 pH、盐离子浓度和外界温度可促使其发生凝胶化。Freytes 等[32]用氢氧化钠将猪膀胱 dECM 溶液调至中性（pH ≈ 7.4）后，改变溶液中盐离子浓度以形成预凝胶，然后通过升温至 37℃ 形成水凝胶。dECM 溶液预凝胶化是 dECM 水凝胶形成前的关键步骤，临床人员可将该时期的 dECM 预凝胶注射至手术部位，在人体温度（37℃）下，dECM 预凝胶可迅速形成 dECM 水凝胶。研究表明，dECM 溶液中胶原蛋白单体自组装形成聚合体的过程中熵增加促使了水凝胶的生成，该成胶反应在较低盐离子浓度（0.5 × PBS）下被促进，在较高盐离子浓度（1.5 × PBS）以及温度小于 22℃ 时被抑制。

1.2.3  dECM 水凝胶的评估

① 水凝胶的微观结构：组织脱细胞以及 dECM 溶解过程中，原有纤维网状结构已被破坏，随着成胶反应的发生，dECM 溶液中胶原蛋白单体经自组装又形成了新的三维多孔结构。影响 dECM 水凝胶结构的因素主要包括组织 dECM 的来源、凝胶化条件以及水凝胶中各类蛋白浓度等。不同组织来源的 dECM 水凝胶纤维直径差异较小，凝胶化条件的改变以及各类蛋白浓度对孔径影响较大。Ungerleider 等[24]使用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）观察猪骨骼肌和心肌 dECM 水凝胶，发现重组后的纤维直径分布在 30～250 nm，平均为 100 nm。Lin 等[20]通过 SEM 观察戊二醛交联后的神经 dECM 水凝胶，发现该水凝胶具有纳米级多孔结构，重组后的纤维直径在（55 ± 14）nm，纤维距离分布在 200～300 nm 之间。② 水凝胶的粘弹性：dECM 预凝胶的黏度和凝胶动力学等特性决定了可注射性以及能否保留在特定部位，是其能否成功用于微创手术的重要衡量标准。Sackett 等[17]通过比浊法对胰腺 dECM 水凝胶进行了动力学分析，结果发现胰腺 dECM 水凝胶显示出类似于Ⅰ型胶原蛋白的“S”形动力学曲线，且两者达到最大浓度吸光度值的一半时所需时间（T1 / 2）相似。但胰腺 dECM 水凝胶的滞后时间为 5～6 min，短于Ⅰ型胶原蛋白（10～15 min），表明在 37℃ 时，dECM 水凝胶较胶原能更快地发生凝胶化，最后凝胶化过程所需总时间相同。另外 Wu 等[16]还发现，不同浓度猪半月板 dECM 水凝胶的比浊凝胶动力学曲线显示出类似的“S”形曲线，且水凝胶的滞后时间和凝胶化速率基本不受浓度改变的影响。

2  dECM 水凝胶的临床前研究

dECM 水凝胶由于具有与自体组织类似的组成和结构，已被广泛应用于组织工程和再生医学领域的研究。目前已有科学家将 dECM 水凝胶作为基础材料，通过加入某些活性成分以及改进其机械性能来模拟机体内部的微环境，从而实现个性化治疗，为 dECM 水凝胶临床应用奠定基础[5-6, 11]。不同组织来源 dECM 水凝胶的制备工艺及应用效果见表 1。

表1 不同组织来源 dECM 水凝胶的制备工艺及应用效果

2.1  心脏

组织损伤后血管的生成对心肌梗死等缺血性疾病的治疗起到了至关重要的作用，dECM 水凝胶作为良好的生物支架材料，能够有效地促进血管生成和加快组织修复[5]。Jang 等[11]分别在猪心脏 dECM 水凝胶及胶原两种材料上种植人源心脏祖细胞（human c-kit cardiac progenitor cells，hCPCs），7 天后发现心脏 dECM 水凝胶能显著增强 hCPCs 的黏附、增殖和成心肌分化。将通过 3D 打印技术构建的心脏 dECM 水凝胶仿生支架植入心肌梗死模型大鼠，发现混有间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）以及血管内皮生长因子的 dECM 水凝胶组中，大鼠左心室的厚度、组织中血管数目和直径、射血分数和缩短分数均明显增加，表明心脏 dECM 水凝胶不仅可作为载体材料对祖细胞心肌化、血管生成以及心脏组织的修复产生重要调节作用，而且可作为微创手术的植入材料，减少因手术治疗造成的周围组织损伤。Singelyn 等[10]对人冠状动脉内皮细胞（human coronary artery endothelial cells，HCAECs）和大鼠主动脉平滑肌细胞（rat aortic smooth muscle cells，RASMCs）在猪心脏 dECM 水凝胶中的迁移情况进行评估，发现 dECM 水凝胶可明显促进两种细胞向其周围迁移，RASMCs 在 dECM 水凝胶组中的迁移数目约为对照组的 2 倍。随后将 dECM 预凝胶注射到 SD 大鼠左心室壁内，术后 4 h 即可观察到新生小血管，11 天时在注射部位发现大量 HCAECs、RASMCs 以及直径大于 10 μm 的新生血管，新生小血管数量显著增加，证明 dECM 水凝胶具有良好的促血管生成的能力。

2.2  胰腺

尽管目前胰岛素的使用已十分普及，但每年仍有数百万人由于血糖控制不佳以及糖尿病相关并发症而丧失生命。近年来也有学者提出将干细胞与胰腺 ECM 组分混合，以微创手术的形式，将水凝胶注射到体内从而对糖尿病进行治疗。例如，Sackett 等[17]制备人源胰腺 dECM 水凝胶，将胰岛素瘤细胞系和人脐静脉内皮细胞种植于胰腺 dECM 水凝胶上，结果显示 dECM 水凝胶可为细胞黏附生长提供良好的微环境，且细胞存活情况以及胰岛素分泌指数与Ⅰ型胶原类似。动物实验中，将胰腺 dECM 水凝胶和人胎儿胰腺组织植入裸鼠背部皮下，术后 4 周取出植入物，结果发现对照组中小鼠产生强烈的炎症反应，而实验组胰腺组织 dECM 水凝胶组并未发现有明显的炎症细胞浸润，表明该水凝胶具有较低的免疫原性，有望成为临床中辅助治疗糖尿病的新型材料。Chaimov 等[18]开发了一种基于猪胰腺 dECM 水凝胶的新型细胞微胶囊化平台（pancreas encapsulation platform），以用于糖尿病的治疗。将包裹成人肝细胞（adult human liver cells，AHLC）和 MSC 的胰腺 dECM 水凝胶注射至 SCID Beige 糖尿病小鼠皮下，每隔 3 日检测小鼠血糖含量。结果显示未经处理的对照组小鼠血糖浓度一直维持在 350 mg/dL 左右，而包裹细胞的胰腺 dECM 水凝胶组中小鼠血糖浓度明显下降，7 天内由 350 mg/dL 降至 210 mg/dL，随后逐渐上升至 300 mg/dL 并趋于稳定，此结果证明包裹细胞的胰腺 dECM 水凝胶可明显改善小鼠血糖浓度，有助于糖尿病的治疗。

2.3  肝脏

梁成宵等[14]将肝细胞 BRL-3A 种于大鼠肝脏 dECM 水凝胶表面，以对其细胞毒性以及增殖、黏附等生物学活性进行检测。与空白培养板相比，肝脏 dECM 水凝胶细胞毒性较低，利于细胞的存活；对细胞骨架染色后发现黏附于 dECM 水凝胶表面的细胞呈梭形，且每个视野下细胞黏附数量（84 ± 8）个明显多于对照组（53 ± 7）个，证明 dECM 水凝胶具有良好的生物相容性，为后续水凝胶在肝脏疾病领域的应用提供了实验依据。Wang 等[31]将大鼠肝脏 dECM 水凝胶均匀铺于细胞培养板上，细胞毒性检测结果显示人源骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BM-MSC）在实验组中生长良好，增殖较普通基质胶覆盖的细胞培养板明显增加；免疫荧光染色结果显示 dECM 水凝胶组中 BM-MSC 分泌的尿素、白蛋白和甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）等因子数量更多，表明肝脏 dECM 水凝胶可作为一种理想的支架材料，具有较强的促 BM-MSC 朝肝细胞分化的能力。

2.4  神经

Prest 等[21]将狗外周神经 dECM 水凝胶填入硅胶神经导管内，随后植入 SD 大鼠坐骨神经缺损模型。术后 3 周结果显示 dECM 水凝胶能够促使巨噬细胞和施旺细胞向其周围迁移，并诱导 M2 型巨噬细胞比例显著增加，M2 与 M1 型细胞之比接近 1.5∶1，而在对照组中两者之比仅为 0.5∶1，组织修复速率明显不及实验组。Lin 等[20]利用猪源外周神经 dECM 水凝胶（pDNM-G）培养施旺细胞，发现 pDNM-G 具有促进细胞增殖以及维持细胞形态的作用。体内免疫反应评估结果显示，dECM 水凝胶具有较低的免疫原性，可激活 M2 型巨噬细胞，促进组织损伤的修复。在小鼠坐骨神经 15 mm 缺损模型中，填充有 pDNM-G 的静电纺丝导管组中轴突的再生长度可达 6 mm 左右，约为对照组的 2 倍；随后对再生神经的功能进行评估，发现实验组中运动神经传导速率明显快于对照组，达 20 m/s 以上。以上实验结果表明 pDNM-G 可作为一种良好的生物支架，具有促进神经组织损伤修复的作用。

2.5  其他

Keane 等[7]将猪 SIS dECM 水凝胶植入葡聚糖硫酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型，发现 dECM 水凝胶可作为一种良好的粘合剂，附着于肠壁并与细胞紧密结合。同时 dECM 水凝胶能够增加病变部位 E-钙粘蛋白阳性细胞的数目，减少肿瘤坏死因子-α 等促炎因子的释放，促进结肠炎大鼠上皮组织的修复。病变部位 7 天后已基本修复，与正常组织无显著差异，证明 SIS dECM 水凝胶可快速促进溃疡性结肠炎的愈合。Wu 等[16]将猪半月板 dECM 水凝胶涂抹于聚苯乙烯培养皿表面，培养牛软骨细胞和小鼠成纤维细胞。相比于聚苯乙烯，半月板 dECM 水凝胶能显著促进细胞的增殖，且在 7 天时细胞数目高于对照组约 30%，细胞存活率约为 90%。将 dECM 预凝胶注射至小鼠背部皮下，在材料植入初期可观察到粒细胞快速迁移至注射部位，7 天时可观察到巨噬细胞大量浸润，但并未引起强烈的特异性免疫反应。上述实验结果均表明半月板 dECM 水凝胶具有良好的生物学性能以及较低的免疫原性，可为后续临床试验提供依据。

3  展望

虽然 dECM 水凝胶对多种损伤组织的修复具有显著促进作用，但不同组织来源 dECM 水凝胶的成分、力学性能、生物特性以及制备工艺的差异，使其在体内的治疗效果还不稳定。如何选择最合适的 dECM 水凝胶用于特定组织的修复依然有待进一步研究。此外 dECM 水凝胶机械性能往往较差，单纯依靠调节溶液 pH、盐离子浓度以及改变温度的方法只能在一定程度上促使溶液进行交联，并不能够明显提高力学性能。寻找安全有效的新交联方法，改善水凝胶的机械性能，不仅能够获得更好的修复效果，还将扩大水凝胶应用的范围。随着科学家对 dECM 水凝胶研究的不断深入，具有更优良力学和生物学性能的 dECM 水凝胶产品将不断涌现，为临床组织修复提供更多的选择。

原文链接： http://gensurg.cn/article/10.7507/1001-5515.201907027

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