12个WB翻车原因 | 带配图详细讲解，再也不用担心实验失败了

Western Blot方法在SCI文章中出现的频率非常高，漂亮的WB电泳图可以给文章增色不少。但是WB实验步骤琐碎，细节颇多，要想得到令人满意的结果还是需要花很多时间和精力去摸索实验技巧的。

小V整理了针对高频WB异常结果，配图详解 12 个WB翻车原因，让你的条带显露真身

01

无背景无条带

原因分析：

如果 marker 正常，其他位置没有条带，最可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。

解决办法：

• 目的蛋白完全无信号，但同时做的内参是正常的，那么大部分情况是一抗抗体失效或用错二抗。
• 目的蛋白和内参均无信号，则考虑是否发光液失效。如果膜上没有 marker 则为转膜失败。
• 如果中间出现了细微条带，可能是蛋白上样量太少，或一抗浓度过低。
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02

高背景

原因分析：

封闭不充分，一抗浓度过高，洗膜时间次数不够。

解决办法：

降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。

• 一抗/二抗浓度配比不合适：杂带多，大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。
• 封闭液问题：配制封闭液所用的脱脂奶粉应选用无防腐剂实验专用脱脂奶粉。
• 洗膜不充分：洗膜按规定来 5min*5 次或 10min*3 次。

03

非特异性条带

原因分析：

一抗非特异性与蛋白结合。

解决办法：

更换一抗。此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合

04

条带中出现边缘规则的白圈

原因分析：

• 电转中膜与胶之间存在气泡。
• 可能是转膜过程烧膜了，特别是半干转操作不当导致烧膜。
• 转膜时温度过高产生气泡。
• 印迹膜活化不佳。

解决办法：

• 注意排清气泡。
• 优化实验条件或使用湿转法转膜。
• 把整个转膜装置放于 -20 度冰箱中电转。
• 确保印迹膜完全活化。

05

出现黑点和黑斑

原因分析：

• 一般出现这种情况可能是封闭液溶解不完全或封闭液存放时间太久（长菌）。
• 膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合。

解决办法：

• 过滤封闭液或选用其他类型封闭液。
• 与其他品牌已验证过好用的抗体处理相同样本，作比较，看是否还有斑点。

06

条带拖尾

原因分析：

一抗浓度太高和时间太长。

解决办法：

根据情况调整一抗浓度，时间也可缩短。

07

出现非均一性背景

原因分析：

膜可能在孵育或洗涤过程中干过。

解决办法：

每一步的操作过程中，注意不要让膜干。封闭时洗一抗洗二抗，以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干，一旦风干很可能会导致这个结果。

08

某个条带变形

原因分析：

SDS-PAGE 胶中存在气泡或某不溶性颗粒。

解决办法：

配胶过程中，要注意不要使用无杂质液体

09

条带不均一

原因分析：

• 配置胶凝固不均一。
• 转膜问题：转膜夹子不紧，转膜滤纸或海绵由于使用消耗，滤纸及海绵变薄，海绵弹性不足。
• 一抗孵育问题：抗体孵育不充分或抗体稀释液放入过少。

解决办法：

• 把胶配好，不合格的胶坚决不用。
• 及时更换转膜滤纸和海绵。
• 增大抗体稀释液用量、更换跷跷板类型的摇床将膜完全进入抗体稀释液中。

10

最边缘条带弯曲

原因分析：

电泳电流不均一，玻璃板右下侧有缺口。

解决办法：

换用新的玻璃板，不使用两边的两孔。一般我们使用的是 10 孔的胶，如果你上样刚好 10 个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。

11

条带笑脸，marker正常

一般来说笑脸问题首先考虑电泳环节，多半是凝胶没凝固好。但上图 marker 却异常整齐，笑脸条带整齐地手拉手，这就不是凝胶问题导致的。

原因分析：

• loading buffer 失效，导致样品变性失败。
• 上样量过大或样品杂质多。
• 电压太高。

解决办法：

• 更换 loading buffer。
• 超滤样品或降低上样量。
• 降低电压。

12

曝光结果条带扭曲

原因分析：

转膜问题，对于分子量稍大的蛋白，转膜时间过长，转膜装置产热过多，无法维持转膜时的低温环境，造成条带扭曲。

解决办法：

建议在条件允许的情况下直接在 4℃ 中进行转膜，将冰更换为冰水混合物，及时更换转膜液并将转膜液放入 4℃ 中提前预冷。

对于大分子量的抗体，跑胶前可以先把样本煮一下，然后稍微离心一下，同样也可以改善这种情况。

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