原核表达的蛋白复性

寻求各位大神的帮助，我的蛋白大概42KD，含有7个半胱氨酸，等电点预测9.1，用PET28A载体诱导出来，但是以包涵体的形式表达出来的，8M尿素变性后，已经挂镍柱纯化，目前想要进行复性成有活性蛋白用来后面做EMSA，尝试了透析复性（复性液为尿素6M，4M，2M，0M的PBS，PH8.0）发现蛋白在2M时透析袋中就有沉淀了，到全部复性步骤结束，透析袋中出现较多沉淀，跑SDS—PAGE，溶液中完全没有我的蛋白，将沉淀悬浮点样，有我的目的条带，说明我的蛋白全部沉淀了。后来又采用稀释复性，稀释复性的复性液配方是：Tris 50mM，nacl 50mM，EDTA 0.5mM，5%甘油，Arg 20mM，还原型和氧化型谷胱甘肽对5mM和0.5mM，PH调整为7.5，8.0，8.5，复性24h，观察到各种PH的复性液中都有絮状物，复性完后10000g离心2分钟，离心管中没有看到沉淀，但是用上清跑SDS—PAGE，还是没有条带。目前这个复性已经做了1个多月了，还请各位大神指导一下，是哪里出了问题，为什么我的蛋白一直沉淀，非常感谢！