【求助】小鼠原代小胶质细胞培养污染和细胞免疫荧光串色问题

自22年9月开始学习提原代小胶质细胞以来，一直在镜下看到有污染，培养基颜色几乎不变，看园子中的帖子判断可能是念珠菌或者酵母菌污染。目前几乎所有的东西都换了一遍，环境也用过氧乙酸、杀孢子剂、八四、苯扎溴铵等等消杀过若干次，培养箱水盘里目前加了抗真菌和细菌感染的药。再提细胞仍然发现有，但是有时候不影响混合胶质细胞生长，有时候又会让小胶和少突完全死亡，剩下星胶长势还可以。这个学期换成了三抗（青链霉素和两性霉素），这个菌依然出现，决定妥协不管了。到了14天摇小胶，首先，摇下来的细胞形态看起来并不像小胶，其次就是对摇下来的细胞爬片培养两天后进行免疫荧光染色的时候发现，所有的细胞都共标Iba1/GFAP或者Iba1/Oligo2。

大致讲一下我提原代小胶的方法：

1.P0-P3新生鼠，取脑子后PBS洗两遍，在DMEM/F12中镜下剥脑膜，然后转移到新的培养基中，加入无血清的DMEM/F12，吹打10次左右，加入木瓜蛋白酶和DNA酶，37℃消化30min；

2.加入含血清的DMEM/F12终止消化，吹打20次左右，肉眼看不到组织碎片，过70um滤网，1200rpm离心6min，倾倒上清，重悬种板，一天后换液，此后每三天换一次液；

3.补充：PDL铺板至少30min，PBS洗三遍，3个新生鼠种一个75mm2培养瓶；培养基、PBS、血清和三抗用的都是gibco的；

4.混合胶质细胞培养到第14天，180-200rpm摇2h，后收集瓶中的培养基，离心后弃上清，重悬种在爬片上（爬片提前包被PDL至少30min），一天后换液，三天后做免疫荧光；

5.PBS5min×2次，加入预冷的4%PFA，室温固定20min，PBS5min×2次，3%驴血清室温（0.3%PBST稀释）封闭1h，一抗过夜（封闭液稀释），0.05%PBST5min×3次，二抗室温孵育1h（封闭液稀释），0.05%PBST5min×3次；发现串色后缩短PFA固定时间为5min，并把所有用到PBST的步骤换成PBS，再次染色依旧全部共标；

图一和二为污染菌的照片（最开始没有，后面长起来的，会增殖，没有细胞分支形态，因此判断为真菌）；图三为混合胶质细胞培养到第15天200rpm2h后摇下来的细胞，图四为图三细胞换液后拍摄，感觉形态变化很大；图五为摇下来的细胞共染Iba1（红色）/Oligo2（绿色）图片；

想请教走过路过的各位前辈和朋友们解答我的疑惑：1.下图红色圈出的东西是不是真菌污染？2.反复的真菌污染还可以从哪些方面找原因？3. 免疫荧光串色的原因是什么？还可以怎么改进？是否有可能跟细胞状态不好有关？