qpcr 内参一定要选择 GAPDH 嘛

丁香实验

发布于 2023-02-24 · 浏览 1874 · IP 浙江浙江

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Q：请问 qpcr 的内参一定要选 GAPDH 嘛选择的依据除了文献还有什么别的方法嘛

A1：不一定非要选择 GAPDH 啊，βactin 也是可以的

A2：在进行实验中，选择哪个基因作为内参可以根据具体实验情况进行选择，GAPDH 不是一定要选作内参，其它基因也可以作为内参。

在选择内参时，需要考虑以下几点：

基因的表达稳定性：内参基因应该在实验条件下表达稳定，不受处理和时间的影响。因此，应该在实验前对多个潜在内参基因进行筛选，通过统计学方法确定最适合的内参基因。通常建议使用稳定性高的基因，例如 18S rRNA、β-actin、GAPDH、HPRT 等。

基因的表达水平：内参基因的表达水平应该与实验中感兴趣的基因相当。如果内参基因的表达水平与感兴趣的基因存在明显差异，则可能会影响结果的准确性。因此，在选择内参基因时，应该考虑内参基因与感兴趣基因的表达水平。

基因的生物学功能：在选择内参基因时，还应该考虑基因的生物学功能。如果内参基因与实验中的生物学过程存在明显相关性，则可以提高结果的准确性。

除了文献和实验经验之外，还可以使用基因表达数据分析工具，如 GeNorm、NormFinder 等，对多个潜在内参基因进行筛选和评估，以确定最适合的内参基因。

A3：不是的，一般以 actin 或者 gapdh 为内参，内参基因多数都是 housekeeping gene

Q：不加反转录酶，其他成分相同的负对照作为 NRT，结果应该是怎么样的？出现峰值正常吗？

A1：不正常，因为不加反转录酶是不会有产物的，也就不会有峰值

A2：结果应该是没有产物的，出现峰值的话不正常

A3：不加反转录酶的负对照实验，如果其他成分相同，应该不会出现特异性的 PCR 产物，因此不应该出现任何 PCR 产物，包括峰值。如果出现了 PCR 产物，可能是因为污染或其他非特异因素导致，因此应该再次进行实验来验证结果。另外，如果实验中使用了 NRT（Non-Reverse Transcribed Control），那么这个对照组应该是不包含反转录酶的，因此也不应该出现 PCR 产物。

Q：RNA 浓度在 20 纳克，但纯度很高，可以反转录吗？

A1：不可以，这个浓度的话跟空白对照都差不多了，所以不能

A2：一般浓度在 20 以上的高纯度就可以做反转录。

A3：一般来说，RNA 的最低起始浓度应该是 50 纳克左右，但是这并不意味着低于 50 纳克的 RNA 就不能反转录。具体能否成功，还要考虑样品的质量、反转录试剂盒的灵敏度、反转录反应的效率等因素。如果你的 RNA 纯度很高，建议使用高灵敏度的反转录试剂盒，并对反转录产物进行质控和验证。另外，你也可以尝试将 RNA 进行富集或扩增，以获得更高的起始浓度。

Q：pcr 两条引物同时在一条链上会怎样？（两个都是正向引物）

A1：会错排，还会有混乱的互补。结合也会混乱

A2：会复制出很长的一条链。没啥意义

A3：这样一般是引物序列设计不合理，然而就可以导致位于 5'端的引物合成到3'端的引物后无法继续进行，但是 3' 端的引物可以一直复制到 3'末端。

A4：如果 PCR 反应中使用的两个正向引物同时在同一条 DNA 链上，这种情况可能会导致 DNA 片段的扩增。然而，这种扩增可能不太可靠，因为引物的定向通常是面向两个互补的 DNA 链的，因此两个正向引物通常是面向两个互补链的，而不是同一条链。

此外，如果两个引物的长度相同，则 PCR 扩增可能会在引物之间扩增一个相对较小的DNA 片段。如果两个引物的长度不同，则 PCR 扩增可能会在短引物的末端扩增一个相对较小的DNA片段，然后再在长引物的末端扩增更长的 DNA 片段。

总之，PCR 反应中使用两个正向引物同时在同一条 DNA 链上，可能会导致 DNA 片段的扩增，但这种扩增可能不太可靠。建议在 PCR 反应中使用正向引物和反向引物配对，以确保 PCR 扩增的可靠性和特异性。

Q：pcr 的时候目的基因比内参表达还高的原因是什么

A1：1.如果同管扩增，引物之间是否有竞争存在

2.操作加样时是否有失误

3.还有循环次数因素

4.一次的现象不能下这样的结论，建议再重复几次。