肝缺血再灌注模型（HIRI）构建浅谈

01 模型制备

SD大鼠，雄性，8～10周龄。

术前准备：SD大鼠术前禁食12h。

建立70%肝缺血再灌注模型：

1、3%异氟烷气体麻醉，麻醉成功后，采取仰卧位，用棉线将大鼠四肢和头部固定在实验板上；

2、备皮，75%酒精消毒，铺单；

3、取剑突至上腹部纵行正中切口5cm，用镊子夹起腹部皮肤，依次切开、止血，注意避免损伤剑突；

4、腹膜用湿纱布保护，使用腹腔撑开器、小拉钩充分显露肝脏及胃肠道，将肝周围韧带分离；

5、解剖肝门，钝性分离出支配肝左、中叶的肝蒂后，迅速以小号无损伤动脉夹闭；

6、肝左中叶颜色由红色逐渐转为苍白或土灰色，而肝右肝叶颜色无明显变化，说明肝血流阻断成功；

7、阻断45min后移除血管夹，见肝左中叶颜色逐渐红润，说明肝脏再灌注成功。再灌注期间缝合关闭腹腔。

下图为阻断左、中叶肝蒂前、后及再灌注后肝脏颜色变化：

HIRI 24h肝脏解剖图：

HIRI缺血45min再灌注1-28D HE染色：

Sham组大鼠肝索排列规则呈放射状，肝细胞和肝窦内皮细胞形态正常。

HIRI组1-3d凝固性坏死，大量血窦膨胀，红细胞渗出到肝锁，嗜伊红细胞增多，严重坏死，失去肝脏结构，肝索崩解，出血，嗜中性粒细胞渗入。7-14d细胞质空泡化，病灶核固缩，窦扭曲不规则，肝细胞不同程度水肿及气球样变，可波及整个肝小叶。21-28d逐渐趋向自愈，肝索排列轻度紊乱。

SD大鼠HIRI缺血45min再灌注1-28D ALT、SOD、TNF-a、MDA指标含量变化：

缺血再灌注损伤时，氧自由基产生和清除之间的动态平衡被打破，机体清除自由基能力减弱，致使组织中脂质过氧化产物大量蓄积，从而加重炎症反应。SOD是机体清除氧自由基的主要物质，反映生物体对抗脂质过氧化损伤的能力。MDA是脂质过氧化反应的代谢产物，可造成细胞脂质过氧化损伤。与假手术组比较，模型组大鼠术后肝脏SOD活性下降，MDA含量增高，表明缺血再灌注损伤后机体内氧自由基未能有效清除，导致细胞膜脂质过氧化，损伤肝细胞。

02 HIRI相关方向研究

*摘自相关文献

1、在“AMPK激动剂预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的影响及相关机制”中，HIRI 12h、24h、72h后，实验组大鼠肝小叶结构较假手术组紊乱，肝索断裂，部分肝细胞出现水肿、空泡样变性及少许坏死导致的气球样变，中央静脉及肝血窦扩张、充血，肝索断裂，缺血再灌注后24h，对照组与实验组肝组织损伤较12h加重，对照组见肝小叶结构紊乱进一步加重，肝细胞水肿、空泡样变性及坏死增多，中央静脉及肝血窦扩张、充血明显，汇管区可见少许炎症细胞浸润。

2、HIRI 4h后，表明HIRI发生时，肝脏产生大量ROS，EUP减弱了I/R引起的ROS的上升。与假手术组相比，IR组观察到大量红色荧光，说明HIRI发生时肝脏产生大量ROS，而EUPH组红色物质明显减少。“Anti-Inflammatory and Antioxidant Effect of Eucommia ulmoides Polysaccharide in Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating ROS and the TLR-4-NF-κB Pathway”

3、肝I/R损伤是肝移植的一大挑战。严重的I/R损伤直接导致术后挑战性并发症甚至移植失败。如何减轻肝I/R损伤一直是肝移植领域的研究热点。在过去的几十年里，基础和临床研究都致力于开发一种新的策略来预防肝I/R损伤，但仍缺乏显著有效的治疗方法。在“25-Hydroxycholesterol mitigates hepatic ischemia reperfusion injury via mediating mitophagy”一篇中，相关研究表明25HC预处理可减轻肝I/R损伤，有望成为一种新的临床干预手段。

4、在“Ischemia/Reperfusion Accelerates the Outgrowth of Hepatic Micrometastases in a Highly Standardized Murine Model”一篇中，构建结肠癌肝转移的肝缺血再灌注损伤模型，通过caspase-3的免疫组化发现：在对照组中肝叶中很少观察到凋亡的肝细胞。然而，在I/R的肝叶中，坏死组织区域周围的肝细胞中检测到高表达caspase-3染色。这些细胞被发现与浸润淋巴细胞的存在密切相关。

结肠癌肝转移瘤后I/R对肿瘤的生长速率影响：

03 总结

采取阻断70%大鼠肝脏血流缺血45分钟以上建立的肝缺血再灌注模型，结合肝脏组织学以及Suzuki's评分来看，在缺血再灌注不同时间后均出现了不同程度的炎性细胞聚集，肝细胞的坏死。模型组在7d后，ALT、SOD、TNF-a、MDA等指标逐渐恢复自愈。

为提高术后成活率，造模中应注意：

1、大鼠术前应禁食不禁水12h，避免术中胃肠道的干扰；

2、腹中切口尽量小，避免不必要的损伤；

3、分离肝蒂时要非常小心，钝性分离，否则易引起大出血，休克死亡；

4、尽量少干扰其他组织，尤其注意不可损伤肝蒂下方的下腔静脉；

5、夹闭时要一次完成，否则容易出现缺血预适应，影响模型；

6、缺血期应注意保持腹腔充分水化，用湿纱布覆盖暴露部位；

7、术中、术后都应将大鼠放置在保温毯上充分保暖；

8、关腹前腹腔内补液1ml，利于术后恢复。