检验科实习记

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发布于 2023-02-03 · 浏览 2686 · 来自 Android · IP 河南河南

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（2.14号）新增：

一、B族淋球菌核酸检测

定性检测妊娠34-37周孕妇生殖道和直肠分泌物中的B族链球菌DNA。

GBS是导致孕产妇产褥期感染和新生儿感染或死亡的重要原因。能引起母体尿路感染、宫内感染及产后子宫内膜炎，并增加早产或死产风险，亦能导致新生儿感染及死亡，最常见表现为败血症、肺炎、脑膜炎。

检测方法：PCR-荧光探针法

针对B族链球菌基因组特异且无高频SNP位点的序列区域cAMP因子，设计出特异性引物和探针。（SNP：单核苷酸多态性，基因组中单个核苷酸变异导致的DNA序列多态性）

UNG酶避免扩增污染物造成的假阳性结果，内参排除假阴性结果。

UNG酶：这种PCR以dUTP替代dTTP，UNG酶可以降解尿嘧啶碱基，该DNA随后变性就会裂解，在50℃有活性，95℃灭活，所以在升温时就可以降解无关的PCR产物，提升反应的准确度和特异性。并且在95℃灭活后不会影响新扩增的产物U-DNA。

嘿嘿，今天见识到了高级的东西！胎儿无创DNA检测。

用到的都是分子生物学学到的东西，我现在来整理一下啦！

（2.9号）新增：

主要是检测14-24周孕妇外周血中胎儿游离DNA21号，18号，13号染色体数量差异，辅助诊断21（18，13）-三体综合征。

使用的是Illumina 测序方法。

这个是人家公司的测序机器：

操作步骤：

1.先把孕妇外周血离心提取出血清，放入两个EP管中；

2.血清中加入缓冲液，蛋白酶K等试剂，裂解出DNA，再加入磁珠，放置在磁力架上，多次加入缓冲液清洗，弃上清；

3.在管中加入碱性缓冲液，使磁珠上的DNA脱离下来，静置五分钟后离心，使磁珠沉于管底，放于磁力架上，吸取上清50ul，用于后续建库；（所以到这一步，母亲和胎儿外周血中的DNA就全部提取出来了。）

4.在DNA溶液中加入筛选磁珠，也就是大的磁珠，1.7-1.9x的磁珠，吸附母亲的DNA片段，多次清洗，磁力架吸附，弃去磁珠，留取上清，上清所含的就是胎儿DNA了；

5.将上清移入新的EP管中，加入小型磁珠，0.5-0.7x的磁珠

开始建库:

①含有DNA的溶液中加入酶1（含有PTK）将DNA片段补平；

②再加入酶2（），往DNA片段的3'上加上A，可以和文库片段的T进行互补配对，进而完成文库的构建；

③提取的DNA样本中加入公共引物，标签引物，底物等进行PCR扩增；

6.PCR产物中加入纯化磁珠，多次洗涤弃去上清，磁珠中加入TET缓冲液，使DNA游离；（这个时候胎儿DNA就算提取完成了）

7.进行质控：

①Qubit 4.0荧光剂测定荧光值

②Agilent 2100 Bioanalyzer 电泳测定

8.上机测序：Next Seq550测序。

原理很简单，操作很繁琐，这个项目的价格也很贵（两千多），仪器耗材也很贵。

这一周轮到后面的实验室啦，不在窗口了

（2.7号）新增：

一、液相色谱串联质谱：检测维生素D，脂溶性维生素和水溶性维生素（主要是B族维生素）

正在自学质谱，感觉这个东西好复杂

今天实验室的质谱仪还堵了，老师弄了好久

一些小tips：

1.液相色谱串联质谱LC-MS/MS：三重四级杆。

高效液相色谱→质谱仪→数据处理

（离子源→质量分析器→检测器）

三个四级杆串联起来就叫三重四级杆

一般流动相在上仪器前必须经过两个步骤：减压抽滤和超声脱气

减压抽滤：①过滤掉气体，尤其是有机相和水相混合的时候，会产生大量的气泡。这些气泡进入仪器就会堵住仪器和色谱柱，所以要除掉。

②过滤掉不溶性微粒，色谱柱一般是5um的粒径，保证过滤的流动相里面小的毛絮，颗粒都不会进入色谱柱。

超声的主要目的也是为了脱气，另外还有助溶和令溶液混合均匀等作用。不过超声主要是为了去掉溶剂瓶瓶壁和瓶底的气泡，所以没必要超声太久的时间，3-5min足够了。

总而言之，都是为了保护仪器和色谱柱，防止气泡和杂质进入。

氮吹仪：利用氮气是一种不活泼的气体，能起到隔绝氧气的作用，如果加强它周围的空气流动，提高他的温度，就可以达到防止氧化的目的。同时采用对底部进行加温，而顶部用氮气或空气进行吹扫，通过氮气的快速流动可以打破液体上空的气液平衡，使液体挥发浓缩速度加快、迅速挥发，从而达到让样品快速浓缩的目的

Q1: 母离子扫描分析--质量过滤

Q2：碰撞碎裂--碰撞池

Q3：对离子进行扫描分析--质量过滤

平衡十分钟，使柱子温度和流动相稳定。

2.MALDI-TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱：微生物的Vitek MS

3.电杆耦合等离子体质谱ICP-MS：无机，微量元素测定

二、结核杆菌T-SPOT：酶联免疫斑点法检测结合杆菌感染的T细胞。和书上说的理论知识一样，但是实际看老师做还是很不一样滴。

第一天：

1.在 15ml 离心管中加入 4-5ml 新鲜血样，按照 1:1 比例向血样中加入1640培养基并混匀;

2.向分装好的细胞分离液中（4ml）中贴壁缓慢加入混匀的血样并离心;

是用的Ficoll分离液，但是是厂商配好的。

3.将淋巴细胞膜层吸净加入新的 15ml 离心管，并加入1640培养基至 10ml并离心;

4.弃上清，加入 1640 培养基至 7ml，將底部的细胞吹打混匀，离心;

5.弃上清，加入 AIMV 培养基 500ul，吹打混匀;

我搜的AIMV培养基是不含血清培养基，可以使淋巴细胞生长的很好。

6.Ep管中加入 40ul 台酚蓝，并加入10ul细胞悬液混匀并取 10ul 计数板计数为N;

7.向细胞悬液中加入(N-50)*10=AIMV ul，稀释;

8.每个样本设置空白对照，测试孔，阳性对照三个孔，分别加入 100ul AIMV培养基，特异性抗原，阳性刺激物；分别加入 100ul 稀释后的细胞悬液，培养过夜。

第二天：

1.弃去细胞培养液，洗板 4-5 次，轻叩干

2.加入 100ul 抗体，室温孵育 1h，洗板 4-5 次，轻叩干

3.加入 100ul 酶，室温孵育 1h，洗板 4-5 次，轻叩干

4.加入 100ul 显色底物，室温避光孵育 7min （冬天 37 度孵育箱中避光孵育）

5.流水冲洗，干燥。

一、自身免疫性血管炎抗体谱检测：免疫印迹法。

检验原理：把PR3, MPO, GBM的IgG抗体转移至硝酸纤维膜上，封闭，加入稀释过的患者血清，孵育，待血清中抗体与相应固相抗原发生特异性结合生成抗原抗体复合物，加入HRP标记的抗人IgG抗体，孵育，洗涤，加TMB底物显色。

二、抗核抗体谱检测：免疫印迹法。

三、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)检测：磁微粒化学发光免疫分析法

仪器：热景C2000(EDTA或肝素抗凝血)

双抗体夹心法，用碱性磷酸酶标记抗Lp-PLA2抗体。

在中心实验室窗口待了一周，记录一下所见所想和一些问题。

（2.5号）新增：

一、免疫荧光层析法测定粪便血红蛋白：用的是荧光标记的抗血红蛋白抗体，加样后等待15分钟，反应结果肉眼不可见，使用干式荧光免疫分析仪测定结果。

正常：＜20ug/g

二、早产诊断快速检测：胶体金法测胎儿纤维连接蛋白和胰岛素样生长因子结合蛋白。

早产(preterm labor) ：是指妊娠满28周至不满37周间分娩者。

早产婴儿具有发生致死性并发症的高危险性。目前，有两种手段用于早产的预测，一是用超声检查宫颈长度,如果宫颈长度<1.5cm则早产的可能性增加；

另一种方法是检测宫颈、阴道分泌物的fFN。检测fFN可反映羊膜的完整性，具有较高的阳性预测值。

fFN：为糖蛋白，这种蛋白质在细胞表面、血浆和羊水中均存在。胎儿fFN能与FDC-6单抗进行特异性反应。发育胚胎黏附于子宫内膜表面，fFN起到重要作用。当妊娠囊植入子宫壁的妊娠早期，阴道分泌物可检测到fFN。在妊娠24周后，宫颈阴道分泌物则无法检测到fFN,除非绒毛蜕膜连接被破坏或胎膜破裂。分娩开始时,胎盘和子宫壁间的细胞黏附破坏，使子宫颈和阴道分泌物中的fFN含量增加。

[临床意义] ◆正常妊娠20周前阴道后穹窿分泌物中fFN可以≥50ng/mL,但妊娠22--35周期间阴道后穹窿分泌物中fFN应<50ng/mL，至36周后有可能为≥50ng/mL；

◆fFN在阴道后穹窿分泌物中的浓度以≥50ng/mL为临界值,但随浓度增高早产风险增大、自娩几率增大，二者呈线性相关。

对于无症状妊娠妇女, fFN检测应在妊娠24~ 30周期间进行。通过涂抹阴道后穹隆采集阴道拭子，将拭子贮存于缓冲溶液送检。

胰岛素样生长因子结合蛋白：待我过去翻一下说明书……

三、肺炎抗体快速检测：胶体金法测定肺炎支原体衣原体的IgM抗体。

肺炎衣原体CP：真核细胞寄生，有独特的发育周期，可以通过细菌滤器。引起急性呼吸道感染。

肺炎支原体MP：引起非典型性肺炎。

四、氧化型低密度脂蛋白测定：磁性微粒免疫层析法。

OxLDL是变性LDL中的一种，结构和生物学特性发生改变，不能由LDL受体识别，只能通过巨噬细胞清道夫受体识别，容易导致巨噬细胞内脂质堆积而生成泡沫细胞，导致动脉粥样硬化。

使用磁性微粒标记OxLDL单抗，加样后等待15min，用磁定量免疫分析仪上机检测。

结果：＜75U/L为冠心病风险低危险。