微生态制剂干预对社区糖尿病肾病患者肠道菌群的影响研究

糖尿病肾病作为糖尿病血管并发症中常见的一种类型，主要变化是起始于肾小球以及肾小管肥大的结构改变，同时伴随着肾脏基底膜增厚以及系膜的扩张，最终会进展为肾小球硬化、肾间质纤维化以及肾小管萎缩等[1]。在全世界范围内糖尿病肾病是死亡率较高的疾病之一[2]。2016年的一项统计数据显示，全球超过4亿人患有糖尿病，超30%的患者最终会演变为糖尿病肾病[3]，然而糖尿病肾病的发病机制尚未完全明确，现有的医疗措施仅能够延缓病情发展，无法治愈。

由人体肠道中的各类微生物菌落（真菌、细菌以及噬菌体等）所构成的共生环境即为肠道菌群，种类极其繁多，数量庞大[4,5]。细菌作为最多的微生物菌落，最常见的优势细菌是乳酸菌、双歧杆菌以及拟杆菌等[6]。肠道是此类菌群的代谢和活动场地，因此其代谢活性以及组成成分、比例发生改变就会导致肠道菌群失调，内环境失衡，继而影响肠道功能[7,8]，同时也间接影响肠道外脏器（肝、肾等）的代谢活动。

近年研究显示，肠道微生态结构和多样性变化导致的菌群失调在糖尿病和慢性肾脏病中发挥着与疾病互相影响的作用[9]。一方面，细菌和细菌产物如脂多糖从内脏易位到血液，通过增加肠道通透性引起2型糖尿病、慢性肾脏病和终末期肾脏病典型的低度炎症。另一方面，肠道菌群在物种丰富度、多样性、组成和功能方面的变化可能会通过代谢物的营养利用和合成变化对宿主产生影响[10]。益生菌通过抗氧化应激和抗炎途径发挥对糖尿病和肾脏疾病的治疗作用，而氧化应激、慢性低度炎症在基础层面影响着糖尿病肾病。本研究旨在探究糖尿病肾病患者的肠道菌群特殊变化，根据微生态失调情况选取合适的益生菌制剂进行干预，了解微生态制剂疗效，从而阐明糖尿病肾病发病和进展过程中肠道菌群结构变化所发挥的作用，明确肠道菌群与糖尿病肾病之间的联系，为社区糖尿病肾病患者肠道菌群失调的有效治疗提供参考。

1　对象与方法

1.1　研究对象

采用分层随机抽样的方式选取2019年在上海市杨浦区殷行社区卫生服务中心就诊的115例糖尿病肾病患者作为研究对象。根据1∶1比例平行对照设计试验方案，设置显著性水平（α）=0.05，置信区间（CI）=95%，采用双侧检验，结合计算公式并考虑临床实践中退出研究或失访的可能性，设样本量n=115。本研究经上海市杨浦区殷行社区卫生服务中心伦理委员会批准（伦理批号：2018-01），115例患者均签署知情同意书。

纳入标准：（1）符合糖尿病肾病诊断标准[11]；（2）年龄40~80周岁。排除标准：（1）特殊类型糖尿病以及妊娠期糖尿病；（2）研究开始前15 d以及研究期间出现腹痛、腹泻等肠道疾病；（3）研究开始前15 d以及研究期间有各类益生菌以及肠道抗生素服用史；（4）其他原因引起的继发性肾脏疾病，如高血压肾病、IgA肾病以及肾炎综合征、肾病综合征；（5）患者并发其他内分泌性疾病（如甲状腺功能亢进症等）、恶性肿瘤、消化系统疾病、血液系统疾病等[12]；（6）患者并发糖尿病急性并发症，如糖尿病酮症酸中毒、糖尿病非酮症性高渗性昏迷等。

1.2　相关定义及诊断标准

1.2.1　糖尿病

依据2019年美国糖尿病协会发布的糖尿病诊断标准[13]：（1）伴有糖尿病相关症状（多尿、多饮、多食以及体质量减轻），同时全天任一时间血糖≥11.1 mmol/L；（2）空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L；（3）口服葡萄糖耐量试验（OGTT）中2 h血糖≥11.1 mmol/L。以上3个标准中符合任一个即可诊断为糖尿病。

1.2.2　糖尿病肾病

依据《中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南（2019年版）》[11]，即由糖尿病引发的患者肾功能损伤，同时尿微量白蛋白与尿肌酐比值（albumin/urine creatinine ratio，ACR）>30 mg/g，或者患者的肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）<60 ml·min-1·（1.73 m2）-1，总持续时间超过3个月即可诊断为糖尿病肾病。

1.3　研究方法

1.3.1　一般资料

收集患者的一般资料，包括性别、年龄、体质指数（BMI）、早期糖尿病肾病比例（糖尿病肾病分期标准：早期指ACR为30~299 mg/g，中晚期指ACR≥300 mg/g[14]）、糖尿病肾病病程。

1.3.2　实验室检查指标

采集患者清晨空腹外周静脉血3~4 ml，并收集存放于无热原的促凝管中，采血管做好相应标记[15]；分离血清，转速4 000 r/min，时间5 min，分离后的血清采用EP管进行分装（每管血清200 μl左右），同时放置于-80 ℃的冰箱中低温保存备用。FPG、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、ACR以及胱抑素C（Cys-C）均采用全自动生化分析仪进行检测；C反应蛋白（CRP）采用免疫比浊法检测；肿瘤坏死因子α（TNF-α）以及白介素（IL）-1β采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。利用肾脏病膳食改良试验（MDRD）公式计算估算的肾小球滤过率（eGFR），eGFR=186×〔Scr（mmol/L）/88.4〕-1.154×年龄（岁）-0.203×0.742（女）[11]。

1.3.3　细菌培养

（1）细菌培养试剂：单原性培养基（赛默飞，500 ml/瓶）、冰醋酸（济南鑫顺化工有限公司，25 L/桶）、结晶紫（默克，25 g/瓶）、硫酸新霉素（默克，5 g/瓶）、迭氮钠（捷世康，100 g/瓶）、卵黄液（环凯，5 ml/支）、布式肉汤（青岛海博，250 g/瓶）。（2）细菌培养仪器：电子天平（上海精科天美，型号：JA2603B）、生物安全柜（赛默飞，型号：V147805）、恒温培养箱（赛默飞，型号：V252445）、厌氧培养箱（徕谱，型号：HYQX-I）、培养皿（NUNC，型号：150462）。（3）粪便样本收集：样本收集前一晚用75%乙醇浸泡收集瓶，经0.9%氯化钠溶液冲洗后分发至患者；患者取中段便置于收集瓶内，确保收集瓶内达到1/3容量；将每位患者的标本分为两份，一份于-80 ℃冰箱中保存备用，另一份即刻做细菌培养[16]。（4）肠道细菌培养：将患者的粪便标本接种于双歧杆苗、拟杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌及梭菌（均购自青岛海博，250 g/瓶）的单原性培养基上。需氧菌于37 ℃普通培养箱培养，培养时间为72 h；厌氧菌于37 ℃厌氧培养箱培养，培养时间为72 h[17]。结果计算以每克湿粪的菌落形成单位（colony forming unit，CFU）的对数值（lg CFU/g）表示。

1.3.4　微生态制剂干预方法

均衡糖尿病肾病患者的年龄、性别、尿微量白蛋白和菌群变化情况，利用简单随机抽样法将115例糖尿病肾病患者分为两组，一组给予控制血糖和血压、降脂等常规治疗（对照组，n=57）；另一组除常规治疗外还给予双歧杆菌乳杆菌三联活菌片（内蒙古双奇药业股份有限公司，规格：0.5 g/片，国药准字：S19980004，批号：201601077，用量：4片/次，2次/d）（治疗组，n=58），两组患者均治疗8周。1.4　统计学方法　采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料以相对数表示，两组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　一般资料比较

115例糖尿病肾病患者中男28例、女87例，平均年龄为（62.9±10.0）岁，糖尿病肾病病程为（14.3±7.1）年。对照组和治疗组患者男性比例、年龄、BMI、早期糖尿病肾病比例、糖尿病肾病病程比较，差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2　微生态制剂干预前后实验室检查指标比较

干预前，两组患者各实验室检查指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；与对照组相比，干预后治疗组患者FPG、TG、BUN、Scr、ACR、Cys-C、CRP、IL-1β、TNF-α均降低，HDL、eGFR均升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3　微生态制剂干预前后肠道细菌培养结果比较

干预前，两组患者各菌落数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；干预后，治疗组患者肠球菌、肠杆菌菌落数低于对照组，双歧杆菌、乳酸杆菌菌落数高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

3　讨论

人体的肠道菌群在机体代谢活动中具有不可替代的作用，不仅参与肠道疾病的发生，同时还影响肠道外疾病的发展进程[18]。人体所需的维生素以及部分必需氨基酸就是由肠道内无法消化吸收的多糖经过肠道菌群转化为单糖以及短链脂肪酸所提供，同时肠道菌群还可抑制病原微生物附着于肠道黏膜，激活补体旁路，中和微生物毒素，继而调节机体免疫力[19,20]。肠道细菌是免疫系统发育和功能的重要组成部分。肠道菌群的变化可能是许多炎性疾病发生、发展的重要影响因素。生活方式的改变可能会改变肠道菌群组成比例，进而引发菌群失调。糖尿病肾病的病因和发病机制尚不完全清楚，可能系多因素参与，在一定的遗传背景以及部分危险因素的共同作用下致病。本研究采用分层随机抽样的方式选取门诊患者作为研究对象，研究微生态制剂改善肠道菌群对于糖尿病肾病患者的治疗作用。

糖尿病肾病患者是否也存在肠道菌群失调的情况？部分学者认为，糖尿病肾病患者由于GFR的明显下降，导致肠道的尿酸和草酸盐无法正常排出体外并大量堆积于结肠段，继而引起肠道内环境紊乱、酸碱失衡，引发菌群结构改变，最终导致菌群失调[21,22]。此外，GFR下降所引起的代谢废物累积会透过肠壁进入肠腔，影响肠道益生菌生活环境，益生菌数量下降导致肠道菌群失调。同时，在肠道菌群失调的环境下，微生物的有毒有害代谢产物在肠腔释放、累积，透过肠腔壁吸收入血，加速GFR的降低，最终影响肾功能。对于糖尿病肾病患者，由于肠道菌群失调，肠道上皮细胞屏障功能消失[23]，肠道内累积的大量尿素代谢产物如氨等会透过损坏的肠道屏障，继而被吸收入血，随血液循环至肝脏后，肝内重新合成尿素，加重肾小球滤过负担[24]。并且尿素代谢产物氨还可在肠道内转化为氢氧化铵，引起肠道pH值升高，肠道黏膜屏障功能进一步下降，肠腔内各类微生物代谢毒素均可透过屏障进入血液循环，最终导致全身炎性反应。

本研究结果显示，与对照组相比，经过双歧杆菌乳杆菌三联活菌片干预后的治疗组患者肠道中肠杆菌和肠球菌菌落数明显下降，双歧杆菌和乳酸杆菌菌落数明显升高，可见肠道菌群失调程度明显缓解，同时HDL、eGFR明显升高，TG、BUN、Scr、ACR以及Cys-C等反映肾功能恶化的指标均明显下降，可见患者肾功能有所恢复，最终菌群失调程度缓解的同时伴随着患者肾功能的部分恢复，提示有效的微生态制剂利于调节肠道菌群，恢复菌群平衡，对于降低机体炎性因子水平具有重要作用。

脂多糖作为一种具有高度致炎性的G-菌细胞表面抗原，在体内一般通过Toll样受体2（TLR-2）以及受体4（TLR-4）介导炎性反应。TLR-2和TLR-4可激活核因子κB，继而诱导机体内促炎性细胞释放IL-1以及TNF等炎性因子[25,26]，加剧全身炎性反应，促使肾功能进一步恶化，同时脂多糖引发的慢性炎症还可促使胰岛β细胞程序性凋亡，造成胰岛素分泌不足，最终导致血糖调节功能进一步降低。YU等[27]研究发现，在糖尿病大鼠模型中，TLR-4在肾小球中的表达持续上调，血液中炎性因子IL水平明显升高，伴随尿白蛋白明显增加，慢性炎症加重，肾脏功能恶化。

综上所述，肠道菌群失调与糖尿病肾病的进展具有紧密关联，肠道菌群失调引发代谢性的炎性改变，影响GFR及肾功能，纠正肠道菌群失调可作为一项治疗糖尿病肾病的新靶点[28]。合理应用益生菌、益生元等微生态制剂利于调节肠道的菌群环境，降低机体炎性反应，既能降糖调脂，又能减轻胰岛素抵抗，对于糖尿病肾病的慢性炎症具有积极治疗作用[29]。

需要指出的是，虽然本研究显示应用益生菌、益生元等微生态制剂可降糖调脂，减轻胰岛素抵抗，对于糖尿病肾病的慢性炎症具有治疗意义，但是人体的肠道菌群本就是受到多种外界因素（如精神、压力以及药物）的影响，因此针对肠道菌群的研究设计仍存在一定的争议；此外，本研究仅发现益生菌对于糖尿病肾病患者的肠道菌群具有调节作用，但是具体是通过哪一条路径或者是哪一种因子介导来发挥治疗作用目前不得而知，同时肠道菌群种类繁多，在益生菌特定的治疗剂量或者治疗浓度方面仍存在一定的争议，有待进一步研究验证。

本文来源：沈菲，蒋伟萍，梅小斌，等.微生态制剂干预对社区糖尿病肾病患者肠道菌群的影响研究[J].中国全科医学，2023，26（9）：1112-1117.（点击文题查看原文）

SHEN F, JIANG W P, MEI X B, et al. Influence of microbiota-modulating agents on gut flora in community patients with diabetic nephropathy[J]. Chinese General Practice, 2023, 26 (9) : 1112-1117.

本文无利益冲突。

参考文献略