快报 | 利福平耐药和利福平敏感肺结核患者的气道微生态学

作者： 蔡杏珊，骆阳，张院良，林媛，吴碧彤，曹志忠，胡族琼，吴幸怡，谭守勇

第一作者及单位：蔡杏珊和骆阳，广州市胸科医院检验科

通信作者及单位：谭守勇，国家呼吸疾病重点实验室/广州市胸科医院结核内科

Airway microecology in rifampicin-resistant and rifampicin-sensitive pulmonary tuberculosis patients

Cai X, Luo Y, Zhang Y, Lin Y, Wu B, Cao Z, Hu Z, Wu X, Tan S.

BMC Microbiology, 2022, 22(1):286. 

doi：org/10.1186/s12866-022-02705-9.

PMID: 36447140.

研究背景

肺结核是一种呼吸系统的慢性传染病，仍然是导致单一传染病死亡的主要原因之一，但它一直停留在对单一病原体的研究中。最近的研究表明，许多疾病与原生微生物群的破坏有关。在本研究中，我们调查了耐药肺结核与呼吸道微生物菌群之间的相关性。采用高通量16S rRNA基因测序技术对30例肺结核（PTB组）感染患者的呼吸道微生物群组特征进行分析，并与30名健康对照组（H组）进行比较。根据GeneXpert MTB/RIF检测结果，将30例肺结核患者分为药物敏感组（DS0组；12例）和耐药组（DR0组；18例）。将DS0组和DR0组患者呼吸道菌群与H组进行比较。

研究方法

1.DNA提取：使用4%NaOH液化每份痰液样本并在pH为6.8的磷酸盐缓冲液中缓冲，然后离心并弃去上清液。留取沉淀后提取DNA。按照制造商说明书，使用NEB next micro-biome DNA enrichment kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, US) 提取微生物群落DNA。使用 Qubit dsDNA BR 检测试剂盒（Invitrogen，美国）用 Qubit 荧光计对DNA^®进行定量，并通过在1%琼脂玫瑰凝胶上运行等分试样来检查质量。

2.PCR扩增：使用简并PCR引物8F（5'-AGA GTTTGATYMTGGCTCAG-3'）和518R（5'-ATTACCGCG GCT GCTGG-3'）扩增细菌16S rRNA基因的可变区V1-V3。正向和反向引物都用Illumina适配器、pad和接头序列标记。在包含30 ng模板、聚合酶和PCR主混合物的50 µl反应中进行PCR富集。

PCR循环条件为：94℃ 3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min，最后延伸10 min，共30个循环。PCR产物用AmpureXP珠纯化并在洗脱缓冲液中洗脱。文库通过Agilent 2100生物分析仪（安捷伦，美国）进行鉴定。经过验证的文库用于按照Illumina的标准流程在Illumina HiSeq平台（BGI，中国深圳）上进行测序，并生成 2×300 bp的双端读取。

3.测序和生物信息学分析：Raw reads被过滤以去除适配器和低质量和模糊的碱基，然后通过Short reads 程序的快速长度调整（FLASH，v1.2.11）将双端reads添加到标签中以获得标签。使用UPARSE软件（v7 0.0.1090）将标签聚类成截止值为97%的OTU，并使用UCHIME （v4.2.40）将嵌合体序列与Gold数据库进行比较以进行检测。再使用核糖体数据库项目（RDP）分类器v.2.2 对OTU代表性序列进行分类学分类，最小置信度阈值为0.6，并通过QIIME v1.8.0在Greengenes数据库v201305上进行训练。USEARCH_global用于将所有Tags与OTU进行比对，得到每个样本的OTU丰度统计表。

MOTHUR（v1.31.2）和QIIME（v1.8.0）分别在OTU级别估计了Alpha和Beta多样性。样本聚类由QIIME（v1.8.0）基于 UPGMA 进行。使用R package v3.4.1绘制不同分类级别的条形图。使用GraPhlAn创建物种组成的GraPhlan图。主坐标分析（PCoA）由QIIME（v1.8.0）执行。LEfSe聚类或LDA分析由LEfSe进行。重要的物种或功能由R（v3.4.1）基于Wilcox测试或Kruskal测试确定。

研究结果

1. PTB组在Alpha和Beta多样性方面与H组的差异均有统计学意义， 但DS0组和DR0组在Alpha和Beta多样性方面的差异无统计学意义。另外，细菌多样性香农指数分析显示，DS0组和DR0组细菌菌群均低于H组（P 值均< 0.001）；而基于unweighted unifrac的DS0组、DR0组和H组的Beta多样性分析显示，DS0组和DR0组的微生物菌群均高于H组（P 值均< 0.001）。具体见图1～ 3。

注 蓝色：H组，橙色：PTB组

图1 基于Unweighted UniFrac距离的PCoA主坐标分析

图2  DS0组、DR0组和H组的Alpha多样性分析

图3  基于unweighted unifrac的DS0组、DR0组和H组的Beta多样性分析 

2.PTB组样本与H组呼吸道样本的物种相对丰度存在差异：从PTB组和H组分布收集60份样本，然后进行测序和聚类，通过16S rRNA扩增子分成600个OTU。Greengenes注释用于将放线菌门、梭杆菌门、拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门鉴定为5个主要门。主要门类是变形菌门和厚壁菌门。相应的优势菌属为奈瑟菌属、嗜血杆菌属、链球菌属和韦荣球菌属。此外，梭杆菌门的主要属是梭杆菌属，而拟杆菌门的主要属是普氏菌属（图4）。在属的水平上，丰度前15种分别为放线菌属、弯曲菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、劳特罗菌属、放线菌属、颗粒菌属、罗氏菌属、梭杆菌属、细线菌属、卟啉单胞菌属、嗜血杆菌属、韦荣球菌属、链球菌属、奈瑟菌属和普氏菌属（图5）。

注 描述了样本群落中所有微生物菌群从门到属的等级关系（从内圈到外圈依次排列）。节点大小对应于微生物菌群的平均相对丰度，显示了两者的优势菌群。浅绿色、红色、深绿色、紫色和蓝色分别代表放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和变形菌门

图4 PTB组和H组优势菌种示意图。Graphlan展示的分类层次树

图5 PTB组和H组所有样本细菌种类丰度组成图，主要为15属

在门水平上，PTB组的变形菌门、梭杆菌门、TM7、Spirochaetes、SR1、Tenericutes的相对丰度均低于H组（分别为25.89%和36.69%、4.76%和9.51%、0.96%和1.75%、0.07%和0.56%、0.18%和0.34%、0.06%和0.16%；P值均< 0.05）；厚壁菌门和放线菌门的相对丰度均高于H组（分别为40.30%和26.75%、6.30%和2.95%；P值均< 0.05）（图6）。PTB组厚壁菌门较H组主要增加了链球菌（17.59%和12.64%）、韦荣球菌（14.43% 和8.65%）和颗粒菌（3.94%和0.74%）（图7）。PTB组放线菌门与H组相比，主要通过罗斯菌（4.57%和1.89%）增加，表达在物种水平上是Rothia aeria（0.219%和0.002%）。两组中相对丰度均<1.5%的属水平包括Turicibacter（0.0023%和0）、分枝杆菌（0.03%和0）、放线杆菌（0.533%和0.501%）和 Scardovia（0.032%和0.002%）、Atopobium（0.34%和0.139%）、放线菌（1.27%和0.689%）、Roseburia（0.0006%和0），P值均<0.05。

PTB组和H组痰标本中前15个菌属的相对丰度有差异的物种是奈瑟菌、流感嗜血杆菌、卟啉单胞菌、梭杆菌和颗粒链球菌（图5），上述两组前4个属相对丰度的细菌含量分别为17.23%和20.40%、4.61%和10.70%、2.71%和4.43%、1.65%和6.74%，PTB组均低于H组，Wilcox秩和检验显示P值分别为0.04、0.00、0.001、0.00；但PTB组中的颗粒链球菌高于H组（3.94% 和 0.74%），P值为0.03。在物种水平上，PTB组的Veillonella_dispar的相对丰度高于H组（10.82%和3.75%，P值为0.01）；但PTB组的Neisseria_sub-flava、Haemophilus_parainfluenzae、Prevotella_pallens 和 Prevotella_nanceiensis 的相对丰度分别低于H组（P值均<0.05）。值得一提的是，分枝杆菌在整个痰菌群中所占比例很小，相对丰度仅为0.03%。关键属的差异见图7。

注  ***、** 和 * 分别表示两组之间的P值 < 0.001、< 0.01 和 < 0.05

图 6 PTB组和H组在门水平上的相对丰度差异（前10位）

注 ***、** 和 * 分别表示两组之间的 p 值 < 0.001、< 0.01 和 < 0.05

图 7 PTB组和H组在属水平上的相对丰度差异（前 10）。

3.在药物敏感组（DS0）和耐药组（DR0）细菌分布存在差异：DS0组和DR0组的相对丰度（前10位）差异均有统计学意义（图8）。DS0组链球菌相对丰度高于DR0组（25.35%和12.41%），主要体现在婴儿链球菌的种属水平上，P<0.05，差异有统计学意义。此外，相对丰度较低的Lachnoanaerobaculum（0.03%和0.21%）和 Lautropia（0.62%和2.23%）在DS0组和DR0组之间差异均有统计学意义，P值均<0.05。

注 DS0组的链球菌相对丰度高于DR0组，P < 0.05

图8  DS0组与DR0组呼吸道样本细菌相对丰度分析

研究结论

肺结核可引起呼吸道微生物菌群紊乱，其中链球菌的相对丰度在利福平敏感患者和利福平耐药患者之间存在显著差异。

本文来自于“中国防痨杂志期刊社”公众号