D二聚体的那些事之五

原创 飞雪梅香 飞雪梅香 2022-11-10 22:09 发表于湖北

前面我们聊了D二聚体的来源、检测原理，以及和各种疾病的关系。那么也就很好理解整个检查过程中容易出问题的环节了，也就知道该如何评价手中的结果了。当然有一条铁律就是永远要先排除病理性的原因，不要简单就归结为生理性升高，也不要轻易下假阳性的定义。下面我们将按实验室检验流程来聊一聊假阳性的那些事。

1、分析前阶段的原因

根据ISO 15189:2012《医学实验室-质量和能力要求》（ISO，国际标准化组织）这一用于实验室认证的ISO标准，分析前阶段被定义为 "按时间顺序，从临床医生的要求开始，包括检查要求、准备和识别病人、收集主要样本、运送到实验室和在实验室内的过程，到分析检查开始时结束"

现在已经明确，实验室遇到的大多数错误都与分析前活动有关。分析前错误的频率为60-70%，远远高于分析阶段（如10-15%）和分析后阶段（如15-20%）发生的频率。分析前的错误主要与密集的手工活动有关。

Salvagno等人研究了当地凝血实验室发现的所有分析前错误，发现最常见的分析前问题与实验室未收到的样品（49.3%）、溶血（19.5%）、凝血（14.2%）和样品量不足（13.7%）有关。他们还表明，在所有凝血样本中，有高达5.5%的样本可以被识别出分析前问题。Grecu等人在1年内进行的另一项研究显示，凝固的样本是他们血液学实验室分析前错误的主要来源（43.2%），而样本体积不合适的情况则较少发生。最近，Dikmen等人在1年的随访中进行了类似的研究，观察到凝固的样本（35%）和容量不足（13%）是导致样本拒绝的主要原因。他们发现，凝血试验的样本拒绝率（13.3%）高于所有其他试验（如生化试验的3.2%，血气的9.8%和尿液分析的9.8%）。

损害样品分析前质量的原因可分为三大类：（i）样品采集（如针头大小、采集管），（ii）样品运送到实验室（如气管系统（PTS）、温度），以及（iii）样品处理（如离心、溶血的样品）。样品的储存和稳定性，以及冻融效应也是分析前过程的一部分。每个分析前步骤都容易出错。因此，在每个步骤中遵循分析前的标准、要求和建议对于保持样品的完整性至关重要。

通过回顾分析前变量对D-二聚体影响的文献，没有明显的偏差被认为是一个强有力的指标。然而，显著差异本身并不对应于临床意义。因此，为了准确评估分析前变量对某一特定分析物的影响，也建议采用一个临床标准。关于D-二聚体，临床上可接受的10%的临界值经常被用来评估分析前的重大变化（尤其是评估干扰物质的影响和进行稳定性研究）。不幸的是，这个10%的分界线并不是从生物变异数据（即参考变化值）中得出的，因为凝血领域仍然缺乏这样的数据。因此，需要进一步验证这个经验性的10%分界线并建立生物变异研究。

1.1样品采集

目前建议使用直径在19至22号（G）的直针。应该用相对无创伤的静脉穿刺获得血样。应避免针头对静脉的过度操作，以限制出现血块的风险，已发现血块有可能影响D-二聚体浓度。通常不鼓励使用蝴蝶装置（小针头连接到灵活的塑料翅膀上，并与弯曲的管子相连），因为血液沿管子通过可能是增强剪切应力的原因，从而有可能引发止血激活、红细胞损伤（即溶血），而且它们也比较昂贵。不过Lippi等人发现，与传统的直针（21G）相比，使用蝴蝶装置（21G，300毫米长的管子）并没有给Mini Vidas®免疫分析仪（bioMérieux, Marcy l'Etoile, France）测量的D二聚体数值带来明显的偏差。这一观察结果意味着，在蝶形装置的管子内发生的止血系统的潜在激活，无论其成分如何，对于D-二聚体的测量可能是可以忽略不计的。Lippi等人还发现，使用不同针孔尺寸（21、23或25G）的蝶形装置，在用Mini Vidas®免疫分析仪再次测量D-二聚体时，临床上的偏差可以忽略不计。综上所述，使用蝶形装置，即使是小尺寸的针头，似乎也是标准直针的一个替代方案。然而，直针静脉穿刺是最好的，尤其是在要求进行其他凝血测试时。因此，在特殊个体（老年病学、肿瘤学、儿科或紧急情况下）可以考虑使用蝶形装置。当使用蝶翼采血系统（或静脉导管）采血时，必须使用弃置管来清除管内的空气，这可能导致采集的血量不足。

1.2管子材料

止血试验首选钝性材料（硅涂层玻璃或聚丙烯塑料），因为这将防止因采血管内虚假的止血激活而导致凝血的开始。Leroy-Matheron等人发现，使用玻璃或聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料收集管（Vacutainer®，Becton Dickinson（BD））测得的D-二聚体数值没有显著差异。Gosselin等人在使用塑料（Vacutainer®，BD和Vacuette®，Greiner Bio-one（聚丙烯））和玻璃柠檬酸收集管（3.2%）时，也没有发现D-二聚体值（高级D-二聚体）的明显差异。最近，Yavas等人将三种塑料柠檬酸盐（3.2%）管（Vacutainer®, BD；Vacutainer® Plus Plastic, BD；和Vacuette®, Greiner Bio-one）与标准玻璃管（Vacutainer®, BD）进行比较，也没有发现明显差异。因此，D-二聚体测量的质量似乎与收集管的类型没有实质性的关系。

1.3抗凝血剂样本（或试管添加剂）

目前，临床实验室标准协会（CLSI）和世界卫生组织（WHO）推荐在绝大多数止血试验中使用含有3.2%（105-109mmol/L）缓冲柠檬酸钠抗凝剂的采集管。建议血液与抗凝剂的比例为9/1，因为柠檬酸钠抗凝剂只能以液体形式使用。如果不能正确填充柠檬酸钠抗凝剂管，通常会延长凝血时间（PT、APTT和TT），也可能导致低估D-二聚体和纤维蛋白原。因此，应检查样本的质量（如凝固、填充不足或填充过多）。血液也应自由流入试管，并在抽血后30秒内迅速混合（即从3到6次完全倒置），从而确保抗凝血剂活性的完全分布。不能接受血清和肝素化/EDTA血浆样本，因为这些添加剂会极大地干扰基于血块的检测（如PT、APTT、FV、FVIII）。 然而，一些D-二聚体检测（包括POC检测）允许使用柠檬酸盐、肝素化或EDTA血浆（Pathfast®、Tina-quant®（罗氏，瑞士））、AQT-90®（Radiometer，丹麦）、Simplify®（Agen Inc，澳大利亚）），而其他检测方法只推荐使用柠檬酸盐抗凝血（如Vidas®、BCS®、STA-Liatest®（Diagnostica Stago，Asnières，法国）、Immulite®（西门子，美国）。 例如，Vidas®, BCS®, STA-Liatest® (Diagnostica Stago, Asnières, France), Immulite® (Siemens, USA) 。Schutgens等人观察到肝素采集管中的D-二聚体平均浓度（Tina-quant® D-二聚体）比柠檬酸盐（2060 µg/L）高，尽管这一差异没有达到统计学意义。肝素血浆中的D-二聚体浓度较高，可能是由于在含有柠檬酸盐的血管中引入了稀释因子。尽管Vukovich等人报告说，肝素化和柠檬酸盐化的样本产生了相同的D-二聚体值（D-二聚体金®，Agen Biochemical），但他们建议使用0.84的校正系数来考虑柠檬酸盐抗凝剂的稀释，这一过程在常规实践中可能会引起混淆。在临床实践中使用其他材质之前，应该对其进行局部评估，尤其是当制造商建议只使用柠檬酸盐样本时。Lippi等人发现锂肝素和柠檬酸钠血管之间的D-二聚体值（Immulite® 2000 D-二聚体）只有轻微的偏差。

使用其他抗凝剂（如肝素）的主要优点是可以测量其他分析物（如电解质、心肌肌钙蛋白）。然而，稀释因子可能是一个混杂因素，可能需要设置特定的算法来校正数据。因此，其他抗凝剂应在当地进行验证，或在特殊情况下使用；因此，缓冲柠檬酸钠（3.2%，或105-109 mmol/L）仍然是推荐的样品材质。

需要注意的是，D-二聚体最初是在血清样本中进行测量的，先去除纤维蛋白原以避免与多克隆抗体的交叉反应。然而，在接受抗凝剂治疗的病人中经常会出现假阳性结果，而当FDP被包埋在血块中时也会出现假阴性值。纤维蛋白肽A的丢失也与非交联的FDP的降解有关。

1.4止血带的使用

止血带通常用于采血时暂时阻断静脉血流，通常建议，一旦针头进入静脉或第一根管子开始充盈时，应立即去除止血带，而且止血带的放置时间不应超过1-2分钟。长时间放置止血带的最重要的缺点包括血液浓缩和血块形成，这可能会影响凝血测试的质量。Lippi等人观察到，在静脉停滞3分钟后采集的样本中，D-二聚体值（Mini Vidas®免疫分析仪）明显增加，增幅为13.4%。停滞1分钟后，也观察到较低的差异（平均增加7.9%）。

1.5样品转运到实验室过程

样品应在环境温度（15-22℃）下，在采集后尽可能短的时间内（通常<1小时）送至实验室。下面将讨论D-二聚体的稳定性。血液样本必须以垂直的方式运送，并且不应取下瓶盖。以垂直而非水平的姿势运送血管，减少了体外微颗粒的产生。目前许多医院用物流输送系统（PTS）运送血样。PTS具有减少周转时间（TAT）的巨大优势，但这些系统在使用前需要进行验证，因为过度的加速/减速、径向重力、振动和气压的变化可能会引发血小板的活化和溶血。Schutgens等人没有发现由PTS运送（≈100米长）的样品与人工携带的样品所测得的D-二聚体值（Tina-quant® D-二聚体）之间存在明显差异。Wallin等人也发现，由PTS运送到实验室的D-二聚体数值（MediRox®检测，瑞典Nyköping）与直接在实验室采集的D-二聚体数值相比，没有实质性差异。与这些研究不同的是，Le Quellec等人观察到由PTS（≈2000米长）运送的样本与由机动车运送的样本相比，D-二聚体数值（DDi-HS 500®，HemosIL®）有明显差异（平均差异为7.4%）。然而，在39个样本中，只有1个样本在500微克/升的D-二聚体分界点上出现了分歧（PTS为510微克/升，机动车为490微克/升），总体差异仍在D-二聚体检测的内部不精确性之内。虽然文献中的数据似乎对PTS对D-二聚体检测结果的影响不大令人放心，但建议每个实验室评估其本地的PTS，因为系统在长度、内径、最大加速力和速度方面都是异质的。

2、标本处理阶段的原因

在进行分析之前，应仔细检查样品是否存在不适当的添加剂、识别错误、体积不足（未遵守9/1比例），甚至是否存在血块。不合适的样品应被拒绝以保护病人的安全。

2.1离心

除（POC）全血D-二聚体分析仪外，样品在室温下以1500×g离心至少15分钟，以便血浆可以可靠地与细胞成分分离。然而，根据Bernard等人的研究，当样品在4500×g离心2分钟而不是1500×g离心15-20分钟时，D-二聚体的值没有任何区别（Vidas®测定）。在紧急情况下，使用较短的离心时间将确实有助于减少TAT。在测量D-二聚体之前，样品可在室温下保存8小时，在4℃下保存24小时（未纺丝的柠檬酸血样）。Elf等人在4℃下离心血样，用两种定量免疫测定法（Innovance®和AxSYM®（Abbott，美国））测定D-二聚体，尽管没有证据支持冷离心法进行D-二聚体检测。

2.2干扰物质

在凝血测试的分析前阶段发生的干扰类型通常分为副蛋白血症、黄疸、脂血以及研究最多的溶血。体外溶血仍然是临床实验室分析前问题的最常见原因之一，其发生率在所有不适合的标本中占30-70%。造成溶血样本的原因可能来自于患者的特征或疾病（如溶血性贫血、代谢紊乱、感染性病原体、基于血红蛋白的血液替代品）、抽血（如 针头G、止血带时间、创伤性抽血、不混合或大力混合血管）、样本运输（如PTS、时间、急诊或重症监护室）、处理（如离心前的延迟、标本重新旋转、运输的时间/温度）和储存（如温度和时间）。干扰也将取决于所使用的分析方法（光度法、凝血法、免疫法）。CLSI指南H21-A5，收集、运输和处理用于测试血浆基凝血试验和分子止血试验的血液标本，建议不要分析有明显溶血的样本，因为受伤细胞释放的促凝血因子可能会对凝血试验产生偏差。

Lippi等人的研究表明，在含有冻融循环（-70℃）获得的最终全血裂解物浓度至少为2.7%的样本中，可以观察到D-二聚体水平（Vidas®检测）的显著增加。然而，只有在无细胞血红蛋白浓度达到13.6 g/L（或最终裂解物浓度≈6.4%）以上时，才能观察到临床上的重大变化（10%）。同一作者的另一项研究评估了机械溶血（装有细针的注射器（30G，0.3×8mm））对两种不同的D-二聚体检测方法（HemosIL AcuStar®（Werfen，美国）和HemosIL HS®（Werfen，美国））的影响。用HemosIL HS®测量的D-二聚体浓度在无细胞血红蛋白5.5-7.0 g/L的溶血指数上达到了临床意义上的下降（-5%）。AcuStar D-二聚体检测法需要更大的溶血量（即11.5-15.0 g/L的无细胞血红蛋白）才能达到同样的D-二聚体下降水平（-5%）。然而，这种偏差从未超过临床上可接受的10%的临界值。D'Angelo等人最近报告说，在BCSxp®检测仪（Siemens Healthcare）上测量轻度溶血（无细胞血红蛋白为0.5 g/L）时，D-二聚体值有明显差异（+6.2%）或机械损伤（旋转刀片匀浆器30s）（+14.9%）。

对评估溶血干扰的研究进行比较是具有挑战性的。首先，使用了不同试剂配方的不同D-二聚体检测方法。其次，使用了不同的技术来获得溶血标本（冷冻和解冻整个抗凝血，通过细针抽吸或用旋转刀片匀浆器对整个抗凝血进行机械裂解）。虽然用溶血剂或纯血红蛋白溶液加注样本被认为是不合适的（考虑到白细胞和血小板的裂解），但用装有细针的注射器获得的机械溶血比冻融法更可取（即它更接近地再现了由于创伤性采血导致的细胞破裂），冻融法也存在不同研究中缺乏标准化的问题（例如不同的温度（-70℃或-80℃）和冷冻时间。第三，使用从生物变异性研究中得出的临床分界线应优先于评估的分析偏差。第四，血样的选择可能会产生不同的结果和结论；在健康志愿者身上产生的数据不一定与在重症监护室病人身上，或在接受多种治疗（即抗血小板或抗凝血药物）的病人身上获得的数据相似。

CLSI建议拒绝所有溶血样品。来自临床实验室的大多数溶血样本（±95%）只是轻度溶血（无细胞血红蛋白0.3-0.6 g/L）。因此，当无细胞血红蛋白的浓度低于无干扰限值（即<3 g/L）时，D-二聚体的数值可能仍然是可靠的，可以安全地报告给临床医生。值得注意的是，避免拒绝所有溶血标本将减少额外的血液采样，并可能缩短临床决策过程，从而对工作人员的工作量、病人的舒适度和成本产生有利影响。

文献对脂血症、黄疸和副蛋白血症的影响讨论得不多。在一份早期的报告中，Pittet等人没有发现脂血症（甘油三酯浓度为9.7g/L）和黄疸（胆红素浓度为485mg/L，829.5µmol/L）对Vidas D-二聚体测定的影响。最近，La'ulu等人在AxSYM D-二聚体检测中发现了类似的结果，在加入胆红素（最终浓度为292毫克/升，499.4微摩尔/升）和甘油三酯（最终浓度为41.6克/升）后，没有临床显著差异（与基线偏差<10%）。Sysmex CA-7000上的Innovance D-二聚体检测似乎也不受胆红素（包括游离胆红素和共轭胆红素，高达1000 mg/L，1710.4 µmol/L）的影响。然而，在加入高浓度的游离胆红素（从800 mg/L，1368.3 µmol/L）后，STA分析仪上出现了虚假的D-二聚体结果。根据Chen等人的研究，用Sysmex CS-5100分析仪测量的D-二聚体也没有受到甘油三酯和总胆红素的干扰。此外，在CS-5100的D-二聚体检测中，HIL检查能够在4个样品中的3个样品中检测到脂血症样品（甘油三酯浓度>4 g/L）。未检测到的样品的甘油三酯浓度非常高（9.43 g/L）。

关于副蛋白血症的干扰，Mugler等人报道了一例D-二聚体水平升高的Castleman病患者。在调查这一发现时，与用STAR凝血仪测量的D-二聚体相比，Western blot上没有发现D-二聚体带。该患者的Castleman病相关的单克隆丙种球蛋白病被确认为是D-二聚体假阳性结果的来源。在Roller等人发表的另一份报告中也假设了副蛋白血症的干扰，并且在Wu等人和Huang等人的报告中也不能排除它。

文献中还报道了由嗜异性抗体引起的假性D-二聚体浓度。只要出现临床差异，就应始终怀疑D-二聚体检测中的潜在干扰。可以使用嗜异性阻断试剂来克服这个问题。与另一种方法进行比较以弄清楚干扰，也是寻找干扰的一个好选择。

2.3稳定性、储存和冻融效应

目前建议样品在测试前应在室温（15-25℃）下保持不超过4小时。然而一些研究表明，D-二聚体可能在更长的时间内保持稳定。这一点尤其值得关注，因为临床医生经常要求在已经从急诊室送来的样本中增加D-二聚体分析。D-二聚体的稳定性在血浆和全血中都得到了广泛的研究。简而言之，D-二聚体在室温（RT）下或在2-8℃下用许多不同的D-二聚体免疫测定法至少稳定24小时（血浆/全血中）。只有Böhm-Weigert和Toulon等人分别提出了6小时和8小时的D-二聚体血浆稳定性，但这是因为他们没有将其分析时间延长。当需要更长的储存期（即几个月或几年）时，也可以使用冷冻样品，特别是用于研究目的。

Schutgens、Zürcher和Gosselin的研究也表明，冻融程序对用三种不同的D-二聚体检测方法测定的D-二聚体浓度没有明显影响。Böhm-Weigert等人评估了四个冻融循环（-60℃或更低）的影响，没有发现血浆D-二聚体值有临床上的显著变化（平均偏差总是<10%）。

总之，虽然D-二聚体主要用于紧急诊断和需要快速测量时，但当样品储存在中心实验室和用于研究环境时，需要提供稳定性信息。表1总结了有关D-二聚体检测的具体分析前数据。

表（1）有关D-二聚体检测的具体分析前数据

2.4 D-二聚体测定法

第一代D-二聚体检测法是在20世纪70年代开发的，能够通过多克隆抗体检测纤维蛋白原和FDP。这些免疫测定只能在血清中进行，以避免血浆中存在的高浓度纤维蛋白原的交叉反应。然而，在服用抗凝剂的病人中会遇到假阳性的结果，而在出现血块的样本中和降解产物包埋到血块中时，会遇到假阴性的结果。

在血清制备过程中，纤维蛋白肽A的损失会影响非交联的FDP的检测。FDP的测量最初是使用（除其他外）基于乳胶固定和凝集、血凝素抑制、葡萄球菌结块、免疫电泳和免疫扩散的方法进行的。

20世纪80年代初，随着针对D域的单克隆抗体的引入，特异性和敏感性有了很大提高。这些免疫测定允许特异性地瞄准D-二聚体表位，而FDP和非交联的纤维蛋白片段中都缺乏这种表位。因此，使用血浆是可能的，因为纤维蛋白原（或FDP）的交叉反应性最小。自从Rylat等人在1983年开发出第一个单克隆抗体（3B6）以来，已经有超过20个单克隆抗体被生产出来并用于实验室实践中。第一代方法的代表主要是定性的乳胶凝集免疫测定，使用抗体包被的乳胶微粒子，需要目测凝集情况。第二代自动乳胶凝集免疫测定法（或乳胶增强免疫比浊测定法）的发展允许通过记录对D-二聚体反应的聚集率来定量测量D-二聚体。一旦加入D-二聚体，乳胶微粒子就会凝结，从而阻止光线通过溶液。用光度计测量的吸光率的增加与D-二聚体的浓度成正比。乳胶增强的免疫比浊测定是快速的，并达到与传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）相当的灵敏度。

在乳胶凝集试验之前，多数采用微板ELISA试验，主要用于研究目的。在这些检测中，一个捕获抗体与板上的D-二聚体抗原结合。孵化后，一个标记的抗体被添加到孔中，并与固定的D-二聚体抗原结合（夹心试验），以促进比色反应。尽管微孔板ELISAs对D-二聚体非常敏感，并长期被认为是参考方法，但它们是手工操作，需要技术能力，耗时长（即约2-4小时），并受到高度分析不精确性的困扰。

20世纪90年代中期，生物梅里埃公司开发了一种基于ELISA的检测方法，带有荧光终点检测（酶联免疫荧光检测法（ELFA））。这种检测方法显示出与微孔板ELISA相似的灵敏度和特异性，其最大的优点是自动化，因此能在更短的时间内（30分钟）产生更精确的结果。Vidas®检测法仍被认为是参考性的商业定量免疫检测法，是临床上验证最多的二聚体测量技术。

最近，已经开发了化学发光酶免疫测定法，显示出与ELISA和乳胶增强免疫比浊法相似的灵敏度。使用涂有D-二聚体特异性单克隆抗体的磁性颗粒；用隔离素标记的抗D-二聚体抗体孵化后产生化学发光反应，与D-二聚体浓度成正比。 

利用床旁快检（POC）D-二聚体检测对全科医生来说特别有吸引力，因为在农村地区、周末并不总是能得到定量的D-二聚体检测结果。在这种情况下，全科医生必须将病人转到中心实验室设施。床旁快检D-二聚体检测的主要意义在于可以快速筛查血栓栓塞性疾病的患者，从而减少紧急医疗机构的过度拥挤情况。大多数POC测试使用全血，是同质的，使用单克隆抗体，并且用时很短。在血凝试验（如SimplyRED®）中，二价抗体对红细胞和D-二聚体具有特异性。在血液中存在D-二聚体时，红细胞会发生凝集，并提供一个定性结果。也有基于免疫层析（如Clearview Simplify®）、荧光（如Vidas® mini分析仪、Triage®、Stratus CS®）和化学发光（如Pathfast®）的检测。一些半定量的检测方法仍在使用（如Dade Dimertest, NyoCard®）。Riley等人最近对市场上不同的POC D-二聚体检测方法进行了汇编。表2总结了D-二聚体检测的主要特点。

表2总结了D-二聚体检测的主要特点

2.5实验室间的差异

2001年发表的FACT研究评估了23种D-二聚体定量检测方法（15种乳胶增强免疫检测法、6种ELISA和2种膜基免疫检测法）在39个样品中获得的平均值从630 µg/L到13,350 µg/L不等（≈21倍），其中两种检测方法对纤维蛋白原降解产物显示出明显的交叉反应性。研究还发现，ELISAs和乳胶增强免疫测定法分别对低分子量交联纤维蛋白和高分子量纤维蛋白的反应性更强。Meijer等人的研究基于357个使用7种常用D-二聚体免疫测定法的实验室，发现一些测定法的D-二聚体浓度比其他测定法高20倍。另一项来自423个实验室的D-二聚体数值比较研究也显示，在接近用于排除VTE的临界值时，结果存在很大的差异性。2014年，在一项涉及3800家实验室的调查中，美国病理学家学院（CAP）凝血资源委员会发现，方法间变异系数（CV）高达42%。根据四份UKNEQAS报告（2017年4月、2017年7月、2017年9月和2018年1月），方法间CV（排除异常值后）分别为33.4%、38.2%、41.8%、30.9%和非FEU和FEU单位的18%、19.3%、17.7%和19%；这四项调查包括736至752家实验室。

2.5.1校准器

纤维蛋白凝块的受控裂解主要用于获得校准材料。因此，制造商必须确保裂解是可重复的，以保持相同种类的尺寸降解产物，因为检测的灵敏度可能会根据高分子量纤维蛋白原（HMWF）或低分子量纤维蛋白原（LMWF）的相对数量而改变。D-二聚体测定可以用纯化的纤维蛋白片段D-二聚体当量进行校准，或根据用于制备校准物的纤维蛋白原量进行校准。因此，D-二聚体单位可根据所用校准物的类型而不同，即D-二聚体单位（DDU）或纤维蛋白原当量单位（FEU）。

2.5.2协调统一与标准化

对D-二聚体表位具有不同特异性的单克隆抗体的使用，缺乏国际认证的内部控制或校准物，以及不同单位和临床阈值的使用，是实验室间巨大差异的主要来源，从而使D-二聚体检测的标准化成为一个具有挑战性的目标，如果不是不可能的话。由于无法满足D-二聚体检测标准化的要求，人们提出了基于数学模型的不太严格的协调程序，以使不同检测方法获得的结果更具可比性。

Nieuwenhuizen等人于1997年发表了实现D-二聚体检测方法统一的首次尝试。准备了不同疾病患者的样本，用5种不同的D-二聚体检测方法（一种Microlatex和4种微孔板ELISA）进行检测，并为每个样本分配了一个 "样本共识值"（对应于每种检测方法的D-二聚体平均结果）。然后，从单个检测中获得的每个池子的结果除以相应的 "池子共识值 "并取其平均值。用于制备池子的样品也被测量，以验证这个模型可以广泛实施。回归系数的平方值从0.7到0.92不等，这使作者得出结论，使用转换系数可能是协调不同检测方法产生的数据的可行方法。

第二次尝试是由Dempfle等人在2001年发表的。总的来说，用23种D-二聚体检测方法（包括微乳剂增强法、膜法和ELISA法）对39个个体样本进行了测试。对于每一种检测方法，通过使用所有检测方法测得的每个样品的中位值来计算转换系数，对于每一种检测方法，使用所有样品获得的中位值。发现单个样品的检测值乘以相应的转换系数，可以有效地提高大多数检测方法之间的相关性。

第三次尝试是由Meijer等人在2006年用正常血浆稀释的50名患者的血浆池来制备5个不同的样本，然后在外部质量控制调查中使用7种不同的D-二聚体检测方法分发给502名参与者。对于每一种D-二聚体检测，每个样品的平均结果与加入的池子的量（检测特定的回归线）作图。每种D-二聚体检测方法获得的平均结果的中位数也与池子的添加量作了对比（参考回归线）。因此，通过使用两条回归线（特定检测法和参考法）的截距和斜率，可以从测量结果中计算出统一的结果。作者表明，通过引入这个模型，可以观察到测定之间的变化明显减少。

第四次尝试是由Jennings等人在2007年将三个校准品和两个测试样本送到500多个使用9种不同D-二聚体技术并参与英国NEQAS外部质量调查的实验室。校准器的单个实验室结果与所有D-二聚体免疫测定获得的中位数结果进行比较。单独的回归线被用来将两个测试样本上产生的数据转换成统一的结果。这种方法有效地提高了校准后的中心间一致性，两个样品的实验室间变异性得到了显著改善（报告为FEU的结果从25.9%降至11.6%，从22.4%降至7.7%；报告为DDU的结果从55.3%降至21.6%，从40.8%降至11.6%）。

统一D-二聚体检测方法可能对播散性血管内凝血（DIC）的诊断和监测特别有用，因为D-二聚体检测方法之间的高变异性可能直接影响DIC评分并导致错误分类。统一D-二聚体结果将提供更好的一致性并改善DIC评分的计算。然而，固有的异质性和协调工作的挑战使得确定一个独特的诊断阈值更加困难，在临床上也值得怀疑，因为假阴性的结果对病人的管理有不利的影响。

尽管如此，上述方法表明，协调统一是可行的，应在更大范围内考虑，类似我们现在的云存储和云计算一样。不过还需要用更多的检测系统对这些模型进行进一步验证，以确认这些模型是否可以推广到所有的D-二聚体免疫检测中，利用大量来自不同临床状况患者的样本，可能有助于生产出稳定的冻干参考材料，其中含有来自LMWF和HMWF的高浓度D-二聚体。可以从该参考材料中产生一系列的D-二聚体值，以获得D-二聚体免疫测定的参考回归线。使用对中低分子量FDP种类显示出高亲和力的单克隆抗体与针对高分子量形式的单克隆抗体相结合也可能是一种可行的替代方法，有利于方便临床运用。

2.6 D-二聚体检测方法性能的建议

由于不同的D-二聚体免疫测定方法（如格式、抗体）的异质性和缺乏标准化/统一性，在VTE管理策略中实施之前，应始终对当地方法的分析和临床应用进行评估。

用于排除VTE的临界值需要在当地确认，按照英国血液学标准委员会指南的建议，至少使用200名受试者。一些制造商也建议对阈值进行本地确认。然而，这种方法对所有的实验室来说可能并不实用；因此，只要在其他地方进行了可靠的验证研究，并且没有发现明显的批次间差异，就可以使用制造商建议的阈值。一些检测方法（如Vidas®、AxSYM®、STA-Liatest®）的临界值已在前瞻性研究中得到临床验证。这可能是选择D-二聚体测定时的一个考虑因素。否则，鼓励与有效的检测方法进行比较。制造商应及时了解有关使用其免疫测定的最新文献，并在需要时更新其阈值。

一项CAP调查显示，美国1506家实验室中，有488家实验室使用的阈值高于文献或制造商推荐的阈值。欧洲的一项调查也强调，24%和55%的参与者使用的阈值分别低于或高于推荐值。最近意大利的一份共识文件推荐使用经认证的定量免疫测定法来检测急诊科病人的血浆。还建议D-二聚体免疫测定法在接近诊断截止点时的不精确性应<10%，测量范围和线性度为50-5000 µg/L FEU。重要的是，D-二聚体测定法不应与纤维蛋白原或FDP发生反应，最好不要与纤维蛋白和由各种酶介导的蛋白分解释放的纤维蛋白原片段发生反应。实验室应始终使用经临床验证的阈值，因为这一诊断阈值在临床决策中起着关键作用。

3、分析后阶段的原因

根据ISO 15189:2012标准，分析后阶段被定义为 "检查后的过程，包括系统审查、格式化和解释、授权发布、报告和传输结果，以及储存检查的样本"

虽然现在已经明确，止血实验室的大部分问题都出现在分析前阶段（60-70%），但分析后阶段仍是大量诊断错误（15-20%）的原因，会危及患者安全。在此，我们讨论针对D-二聚体测量的分析后问题。

3.1 D-二聚体单位

前面我们聊过目前临床实验室使用两种D-二聚体测量单位，即FEU和DDU。FEU（340 kD）和DDU（195 kD）如果乘以2，可以互换使用，因为FEU的质量大约是DDU的2倍。另一个困难来自于使用多达7种不同的测量单位（即ng/mL、mg/L、μg/L、μg/mL、g/L、g/mL和mg/dL）来报告D-二聚体结果。正如最近Olson和Lippi所研究的那样，大多数临床实验室（分别为59%和60%）使用FEU来测量D-二聚体，而在这两项调查中，主要的测量单位是mg/L，其次是ng/mL。在可以采用的计量单位中，"µg/L"（或 "ng/mL"）可能是最接近国际体系（SI）的单位，也是意大利共识文件所推荐的。一些实验室（CAP调查中占8%）甚至不知道他们所使用的测量单位的类型（C主任咨询检验科就遇到这种情况）。

使用不同的单位（FEU或DDU，以及不同的计量单位）对临床医生来说是一种挑战，造成混乱，并有可能导致对患者的错误分类或误诊。1500家美国实验室中，有33%的实验室改变了制造商推荐的D-二聚体单位，这使得情况更加复杂。这些变化给诊断推理带来了额外的混乱，特别是当相邻实验室使用其他单位时。临床实验室应及时将D-二聚体测量单位的任何变化告知相关者。更重要的是，就统一的测量单位达成普遍协议是实现D-二聚体免疫测定协调的迫切需要。

3.2特定年龄的阈值

D-二聚体数值通常会随着年龄的增长而增加，因此导致老年患者中D-二聚体水平高于传统的阈值500μg/L FEU的比例较高。现在普遍建议在报告D-二聚体检测结果时使用年龄调整后的截止值（即[年龄调整后的截止值，μg/L FEU]=[年龄（岁）]）×10）。使用这些分界线可以使阳性预测值（PPV）大幅提高，而不会明显损害阴性预测值（NPV），并最终提高D-二聚体测量对临床概率低的老年患者（即50岁或以上）的临床效用。为此目的，最有效的测试是Vidas®测定（生物梅里埃）。然而，年龄调整策略在STA-Liatest®测定中似乎不太有用。用不同的免疫测定对不同的人群进行分析，至少可以部分地解释这种不协调。这强调了用特定的D-二聚体检测方法获得的结果不能从一种检测方法推断到另一种检测方法。

然而，一项关于D-二聚体检测结果报告的国际调查显示，已公布的关于使用年龄调整阈值的建议并没有得到广泛实施（即只有不到10%的临床实验室实施了这种方法）。除了D-二聚体单位的14种组合外，使用年龄调整后的阈值使临床决策更加复杂，有近30种不同的可能性来报告D-二聚体检测结果。也有人提出了用于孕妇和儿童的具体分界线。然而，由于D-二聚体在整个孕期的生理性增加，确定一个准确的D-二聚体诊断阈值将是一个挑战。妊娠期PE诊断（DiPEP）生物标志物研究最近显示，没有任何生物标志物有效诊断妊娠期或产褥期VTE。

3.3周转时间

周转时间（TAT）是D-二聚体报告中的一个重要方面，因为这种检测大多用于紧急的临床情况。意大利的共识文件最近设定了一个总的TAT<1小时，这似乎适合管理绝大多数的紧急测试请求。

使用D-二聚体免疫测定法的特点是线性范围广（即高达5000 µg/L），无需进行额外的外部稀释，同时使用更快的、经过验证的离心过程、PTS或可靠的POC分析仪，这些都是减少TAT的宝贵方法。手动ELISA不符合推荐的TAT，而最近的中心实验室D-二聚体检测，其分析过程时间在15-40分钟之间，更有可能达到1小时的标准。值得注意的是，由于D-二聚体的半衰期为6-8小时，在这个时间间隔内重复检测是没有临床依据的。在一项欧洲研究中，81%的参与者表示他们每天24小时都在测量D-二聚体。

至此，D二聚体系列完结，大家按照检验三部曲来解读你手上的结果，许多问题定然豁然开朗，也就会明白为何咨询我的时候，我会问那么多问题了，你知道的越多，就想到的越多，排除越多，最终的结果也就越接近真相。

转自微信公众号：飞雪梅香