国自然热点：2022年线粒体相关高分科研思路分享！

线粒体作为发文、中标利器，持续热度下，SCI出现的好文不断，所以，今天分享一篇IF高达14.136分的线粒体相关文章：Mitolysosome exocytosis, a mitophagy-independent mitochondrial quality control in flunarizine-induced parkinsonism-like symptoms，这是一篇关于氟桂利嗪导致的帕金森疾病中线粒体质量控制相关的文章。

研究背景：

氟桂利嗪（FNZ）在欧洲国家与中国被广泛用于治疗中枢性和外周性眩晕、偏头痛、癫痫和闭塞性外周血管疾病。但长期使用该药可能会由于其对多巴胺受体的抑制作用从而引起帕金森综合征。帕金森综合征作为一种神经退行性综合征，与线粒体稳态失衡息息相关。而线粒体质量控制在维持线粒体稳态和功能方面发挥重要作用，作者通过动物与细胞实验探究了FNZ对线粒体的影响。

研究思路：

1、作者首先使用FNZ腹腔注射处理小鼠以观察FNZ诱发的帕金森综合征类似症状

通过旋转杠、旷野、莫里斯水迷宫等运动功能学实验检测小鼠是否出现运动功能障碍；通过体视学分析评估小鼠黑质多巴胺神经元的数量，超高效液相色谱测量了纹状体多巴胺的浓度。通过荧光成像显示FNZ处理前后，小鼠脑中F-FDG（葡萄糖类似物，反应葡萄糖利用率）的荧光强度。最后通过WB检测了线粒体内源性相关蛋白如OMM等的变化，发现相关蛋白减少。表明线粒体质量下降。

2、作者通过荧光成像观测小鼠脑神经突触、神经元、星型胶质细胞细胞中线粒体的含量

因为帕金森综合征被认为是黑质纹状体多巴胺功能障碍的结果，作者首先通过免疫荧光检测了黑质多巴胺神经元中线粒体的表达，发现其含量减少。而后，作者还观察了非多巴胺神经元与星型胶质细胞的线粒体含量，发现FNZ可以广泛降低脑中线粒体表达，而非特异性消除多巴胺功能相关神经元中的线粒体。

3、作者在体外细胞实验观察诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的神经元、神经祖细胞和初级星型胶质细胞中观察FNZ诱导对线粒体的影响

作者首先通过荧光成像直观观察到线粒体的荧光强度下降，线粒体DNA（mtDNA）拷贝数也大大下降。WB条带也显示线粒体相关蛋白急剧下降。作者最后还通过细胞外酸化率、ATP生成、最大呼吸速率分析了FNZ处理后对细胞的影响，发现细胞外酸化率下降、ATP生成减少、最大呼吸效率下降。

4、作者进一步探究FNZ消除线粒体的方式

作者一开始认为FNZ可能依赖于LC3介导的线粒体自噬降解，并以雷帕霉素作为阳性对照，但在FNZ处理的细胞中并未发现明显变化（下图A、B）；作者还观察了FNZ是否依赖典型自噬相关因子ATG5、PINK1、FUNDC1，敲除这些因子后，发现典型的自噬不参与FNZ诱导的线粒体消除机制（下图C、D）。类似的，作者还排除了非典型的自噬相关途径MDV途径、ULK1-RAB9与自噬抑制剂（3MA）（下图E-J）。这些结果表明，典型与非典型的自噬相关机制均未参与到FNZ的线粒体消除相关机制中。

5、作者揭示FNZ通过溶酶体相关的胞吐机制诱导线粒体消除

作者首先采用溶酶体蛋白酶抑制剂氯喹（CLQ）检测到部分逆转了FNZ的线粒体消除作用。作者使用共聚焦图谱分析以及3D重建技术，发现FNZ处理后，大多数线粒体定位于溶酶体中（下图红框所示）。接下来，作者采用电镜直接观察到FNZ处理后，线粒体被单膜结构包裹。这些证据直接表明，溶酶体参与了FNZ诱导的线粒体消除机制。作者进一步联想到FNZ是否能诱导溶酶体依赖的线粒体胞吐作用，溶酶体依赖的线粒体胞吐作用近期被表明广泛参与到病理生理过程中。作者发现FNZ诱导后，胞吐相关荧光染色标记物FM1-43FX标记的质膜包被了线粒体及溶酶体，这表明FNZ诱导的线粒体消除机制依赖于胞吐作用。而后，作者检测了细胞培养上清液中线粒体相关蛋白的表达，发现表达量上调。最后，作者检测了溶酶体融合关键蛋白VAMP2和STX4敲降后是否能阻断FNZ诱导的线粒体消除机制，从功能挽救的角度再次验证了溶酶体相关机制在FNZ诱导中的重要作用。

作者通过环环相扣的步骤，一步步探明并揭示了FNZ诱导的线粒体消除机制的依赖途径，最后发现其既不依赖自噬的经典途径也不依赖非经典途径，而是通过溶酶体及胞吐机制，可留言讨论或咨询！