CRISPR/Cas9基因编辑后的PtargetF质粒消除不掉
发布于 2022-10-17 · 浏览 1979 · IP 浙江浙江
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Q：在对大肠杆菌进行基因成功敲除后，在消除ptargetF质粒时发现消不掉，之前都是一次就消掉了，这次不知道为什么试了两次都没消掉，什么原因造成的？
A：可能是连接引物的问题，引物不合适所以消除不掉。
Q：我在做质粒构建的过程中，意外发现我的质粒上多了一段序列，NCBI检索是IS1转座子，大家知道是什么原因可能导致这样的问题吗？
A：可能是重复序列的原因，导致转座子插入位置错误。
Q：琼脂糖核酸胶浓度越低分离效果越好吗
A1：不是的，一般要根据要电泳分离的核酸的分子量大小：分子量大的核酸电泳时使用浓度较小的凝胶,分子量小的核酸电泳时使用浓度较大的凝胶.核酸在浓度越大的凝胶中电泳速度越小.如果胶浓度偏高,可能跑不动,如果胶浓度偏低,可能跑得太快,分不开.
A2：要根据分子量大小来选择凝胶的浓度。浓度太低，不同大小的分子不好分离开来。
Q：我的大肠杆菌诱导后要进行超声破碎提取蛋白测定活性。我想先诱导然后冻起来，过几个月再提蛋白，请问这样对后期活性测定影响大么？如果冻存的话是怎么冻存呢？
A1：可以-80冻存，但最好现提现做，长时间冻存，会对蛋白活性有影响。
A2：会有影响，建议先把菌液冻存起来，之后要诱导蛋白把菌液扩增起来再诱导。
A3：活性测定最好是尽快做，蛋白提取后在冰上放2-3h活性都有一定下降。
最后编辑于 2022-10-17 · 浏览 1979
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