求助CasRx基因编辑系统sgRNA设计以及overlap 引物设计？
Q：求助CasRx基因编辑系统sgRNA设计以及overlap 引物设计？
A：1.sgRNA设计
1.1设计原则
1） II型CRISPR系统（SpCas 9）的sgRNA 靶点一般为20nt
2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)
3）sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量为30%-70%
4）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高。
5）如果构建U6启动子或H1启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。
6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上，这可以保证蛋白尽可能多的功能域或结构域失效。
7)基因有多个转录本时尽量设计在各转录本的公共区域。
2.常用设计软件和设计流程
1）Broad Institute GPP
网址： https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design
2）Benchling
网址： https://www.benchling.com/crispr
Benchling和张锋实验室设计网站都是比较全面和权威的sgRNA设计网站，以人源TP53基因为例介绍Benchling设计流程
Q：想做药物方案A和方案B对某疾病的疗效。我能纳入某比较药物A.B.C的RCT么
A1：完全可以，你只提取A,B方案的原始数据进行分析就可以，但RCT的纳排标准得符合
A2：可以的，你也可以分成两部分来做，比较清晰。
Q：自己做的兔抗多克隆抗体，在目的条带的位置出现非特异性条带怎么解决
A1：这样就需要调高筛选精度，尽量把非特异性条带筛选掉
A2：非特异条带可以通过更换稍高的分离胶，延长电泳时间将条带侧底分开，多条带有时也有可能是样本修饰或降解，剪切，自己制备抗体抗原的交叉反应等，我们需要重新过一遍实验步骤，再做调整
Q：qPCR标曲低浓度曲线分不开，模板超声没用，超声时间拉了梯度，还是不能区分开标曲后两个梯度。是要更换引物探针了吗？此次引物探针设计的是基因组中重复数量特别高的片段，会不会有这个原因。
A1：建议更换引物探针，高重复性容易导致曲线不明显
A2：有没有考虑过污染的问题？浓度梯度分曲线分不开可能因为稀释的问题，背景值高很有可能是染料污染或核酸污染
Q：根据mega的序列对比，找到有星号※的部分，怎样设计简并引物，需要通过primer5.0软件可以吗？
A1：设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域， 且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜， 使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。
A2：可以的，
1. 利用软件搜索不同物种 中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。
2. 对所找到的序列进行多序列比对。
3. 确定合适的保守区域。
4. 利用软件 设计引物。
5. 对引物的修饰
最后编辑于 2022-10-13 · 浏览 2061
