大师兄带你读文献学习科研思维和课题设计！实战篇8

今天跟大家分享一篇2022.9.30发表在Science上的关于肿瘤细胞分泌促癌代谢物D-2HG改变T细胞代谢，削弱CD8 T细胞功能的研究论文，通讯作者是哈佛医学院的的Marcia C. Haigis教授。

本研究work model如下

摘要

本研究从临床现象出发，即肿瘤患者常常伴有异柠檬酸脱氢酶IDH R132H突变，该突变结果是IDH催化生成更多的代谢物D-2HG。既往研究已经充分证明，肿瘤细胞来源的代谢物D-2HG发挥促癌作用，机制是通过作用在肿瘤细胞本身，通过表观遗传方式促进肿瘤细胞恶性表型（如下图）。

然而，关于IDH R132H突变的肿瘤细胞分泌的D-2HG是否可以在肿瘤微环境中作用于其他细胞进而发挥促癌作用尚不清楚，本研究最大的创新点即在于此。该研究发现了D-2HG可以抑制CD8 T细胞激活后的增殖及免疫杀伤效应。机制是，D-2HG被CD8 T细胞摄取，抑制CD8 T细胞中乳酸脱氢酶LDH作用，进而抑制糖酵解途径，导致NADH堆积，进入线粒体，致使CD8 T细胞糖代谢向有氧氧化偏移。然而CD8 T细胞激活需要糖酵解途径参与，因此D-2HG对CD8 T细胞这种代谢转变导致CD8 T细胞激活能力减弱，抗肿瘤效应被抑制。最后作者回到临床样本中对以上调控通路进行了验证。

研究背景

1. 肿瘤细胞中IDH突变后，导致a-KG在IDH mut催化下生成促癌代谢物2-HG；

2. 葡萄糖有氧氧化功能基本原理：NADH（糖酵解、TCA来源）在线粒体内，通过电子传递链ETC，提供H+，并被由线粒体基质泵出至线粒体内膜，形成线粒体内膜电势差（线粒体内膜超极化），随后H+经线粒体内膜复合物V，从高浓度的线粒体内膜向低浓度的线粒体基质转移，驱动ATP合酶合成ATP；

3.葡萄糖无氧糖酵解包括糖酵解和NAD+再生两个阶段：第一阶段，葡萄糖转化为丙酮酸，同时生成ATP和NAD+转为NADH；第二阶段，在LDHA催化下，丙酮酸转化为乳酸，同时NADH生成NAD+，生成的NAD+反向参与糖酵解，以此维持糖酵解过程顺畅进行。

研究结果

1. D-2HG以一种快速且可逆的方式抑制CD8 T细胞增殖及效应

为了探究D-2HG对TME中其他细胞的作用，首先是要确定探究D-2HG对TME中哪种细胞作用？本研究选择了探究D-2HG对CD8 T细胞的作用。原因有三：1. CD8 T细胞是直接杀伤肿瘤细胞的最主要细胞组分（本文明说的选择理由）；2. 已有一篇Nature medecine文献报道过2HG可被CD8 T细胞摄取，通过促进CD8 T细胞多胺合成，抑制免疫; 3. 该团队研究领域是线粒体代谢。因此，本研究想要从代谢角度去探讨D-2HG对CD8 T细胞的作用及机制，选定了CD8 T细胞。

为此，通过实验首先证实了肿瘤微环境中的D-2HG可以被CD8 T细胞摄取。随后的功能学实验证实D-2HG可以显著抑制CD8 T细胞激活之后的细胞增殖和效应（效应marker：IFNr/CD107/GZMB/Antigen-specific killing），并且这种抑制效应可以随着D-2HG的撤出被迅速恢复，表明具有可逆特性；此外，通过加入D-2HG时间点改变，在CD8 T细胞激活的同时加入D-2HG，也可以在几小时内展现对CD8 T细胞功能的抑制，这表明具有快速特性。

因此，以上实验结果可以得到D-2HG对CD8 T细胞功能抑制的表型如下：

2.D-2HG通过抑制糖酵解途径抑制CD8 T细胞的

既然确证了表型，接着，需要回答以下问题：D-2HG如何抑制CD8 T细胞功能，机制是什么？

D-2HG既往报道通过表观依赖的方式调控靶基因表达，进而发挥作用。然而，本研究发现，D-2HG抑制CD8 T细胞功能具有快速性和可逆性的特点，而表观以来的调控方式，往往具有记忆性，不可逆转性和缓慢特性，因此考虑D-2HG此处应该不是通过表观以来的方式发挥作用。为此，本研究也检测了D-2HG处理对CD8 T细胞中组蛋白marker蛋白水平改变，发现基本无改变，因此可以排除D-2HG通过表观依赖的方式发挥作用。

那么，D-2HG最可能通过哪种方式其作用呢?考虑到酶催化的代谢过程具有可逆性和快速反应性特征，因此作者这里假设D-2HG很可能通过影响CD8 T细胞代谢，发挥抑制CD8 T细胞功能的作用。为了证实以上猜想，本研究首先做了代谢组学分析，发现D-2HG处理后CD8 T细胞中最差异改变的代谢通路及代谢物聚焦到糖酵解途径，并导致代谢物丙酮酸增加，乳酸减少。接着，通过同位素标记葡萄糖示踪，进一步证实了以上结果，即D-2HG处理了导致CD8 T细胞内代谢物丙酮酸增加，乳酸减少，表明丙酮酸向乳酸转化过程受阻。而糖酵解的顺利进行需要LDH催化丙酮酸转化为乳酸后提供的NAD+，当丙酮酸向乳酸转化受阻，糖酵解进行也会被抑制。而CD8T 细胞的激活及发挥效应需要依赖于糖酵解途径，所以以上结果证实，D-2HG可通过抑制糖酵解途径，进而抑制CD8 T细胞功能。

以上结果证实的调控模式如下图所示：

3.D-2HG通过抑制LDH-A抑制CD8T细胞糖酵解

接着，需要继续回答以下问题：D-2HG如何抑制CD8T细胞糖酵解过程？因为，D-2HG处理了导致CD8T细胞中丙酮酸向乳酸转化被阻滞，而催化该过程的关键酶是LDH-A，因此提出假设，D-2HG通过直接抑制了LDH-A的酶活性，进而抑制丙酮酸向乳酸转化，抑制糖酵解过程。关于D-2HG直接抑制LDH-A活性尚未见任何报道。为了将D-2HG直接抑制LDH-A酶活性这一直接逻辑环路给连上，这里，作者通过体外生化酶活性实验，直接将D-2HG和LDH-A混合，检测其对LDH-A酶活性影响，发现D-2HG可以直接抑制LDH-A酶活性，阻滞了丙酮酸向乳酸转化，进而导致NADH堆积，NAD+减少，糖酵解减弱。因此，证实了D-2HG抑制CD8T细胞糖酵解过程是通过直接抑制LDH-A活性来实现的。

以上结果得到的调控模式如下：

4.D-2HG导致CD8T细胞线粒体内膜超极化，功能方式变为有氧氧化为主

细胞活能主要两种方式：1.无氧糖酵解；2.葡萄糖有氧氧化。既然D-2HG抑制CD8T细胞糖酵解，是否会导获能方式转为葡萄糖有氧氧化供能？为此，本研究进行了实验探究，结果证实，D-2HG处理会导致CD8 T细胞获能方式转变为有氧氧化为主。并且，机制上，D-2HG导致糖酵解阻滞，继而导致NADH在胞浆堆积后，通过苹果酸—天冬氨酸穿梭途径进入线粒体，在线粒体中通过ETC，启动增强的有氧氧化获能。

以上结果证实调控模式如下图：

5. LDH抑制剂可以直接再现D-2HG对CD8 T细胞的代谢及功能影响表型

既然D-2HG是通过抑制LDH-A发挥作用，那么直接抑制LDH也应该能够再现D-2HG对CD8 T细胞的代谢及功能影响。为此，本研究选择了LDH两种抑制剂Oxamate和GSK-2837808A（图中简写GSK），通过实验证实，LDH抑制剂可以直接再现D-2HG对CD8 T细胞的代谢及功能影响表型。

6. IDH突变确实可以导致CD8 T细胞代谢及功能改变，并在人胶质瘤组织样本中进行了相关性验证

小结

本研究最大创新之处在于，首次发现D-2HG可以通过直接抑制LDH-A的酶活性，导致NADH堆积，NAD+再生减少，进而抑制CD8 T细胞糖酵解途径，促进CD8 T细胞供能方式向有氧氧化转换，最终抑制CD8T细胞激活后的增殖及功能效应分子表达。整个研究完整的work model如下所示：

本研究逻辑严密，衔接紧凑，逐层深入的机制剖析思路非常值得借鉴。