舒尼替尼耐药株的构建

1、低浓度至高浓度序贯诱导法

肾癌细胞贴壁生长至50%时，更换含舒尼替尼药物的培养基，药物初始浓度为

2μM，培养48h后更换新鲜无药物培养基，细胞状态恢复后传代。每种浓度培养基培

养两代后，按0.5μM浓度递增，直至终浓度为20μM，并以该浓度维持培养。

2、单细胞克隆筛选法

肾癌细胞消化重悬成单个细胞后计数，按每孔1000个细胞加入含舒尼替尼浓度为

5μM培养基的六孔板中，充分摇匀，使细胞单个分布，并于恒温培养箱中培养。单个

细胞贴壁成簇后，消化细胞至培养瓶中扩增，并以含5μM药物培养基维持一代。此后

以10μM、15μM、20μM药物浓度递增培养，最终以20μM药物浓度培养基维持。

为保证肾癌耐药细胞长期冻存后维持其耐药性，可将冻存液中加入浓度5μM舒尼

替尼进行保种冻存。 

检验方法

1. CCK-8 法药物抑制实验

采用CCK-8试剂盒检测肾癌细胞对舒尼替尼药物的半数抑制率（IC50），实验方法如下：取生长状态良好的细胞消化重悬，计数，细胞定量为3×104个/ml；将细胞转种96孔板中，每孔100μl即3000个细胞，培养箱中培养24小时；按浓度梯度配置含舒尼替尼培养基，分别为0μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、16μM、20μM；细胞铺板24小时后取出96孔板，更换上述含舒尼替尼培养基，每个浓度设置三个复孔，每孔200μl；将96孔板放置培养箱48小时后取出，并配置CCK-8工作液；将CCK-8试剂与培养基按1:9比例充分混匀，完全去除96孔板中陈旧的培养基，向每个孔中加入100μl的CCK-8工作液；96孔板重新放置培养箱孵育2个小时；酶标仪检测450nm波长时的吸光度值，绘制药物剂量反应曲线图，然后计算IC50值。

2. 单细胞平板克隆形成实验

细胞消化重悬并计数，细胞数定量为 1×104 个/ml；准备六孔板，每孔加入 4ml

含舒尼替尼浓度 5μM 的培养基；向每孔加入 100μl 细胞悬浊液即 500 个细胞，并混

匀使细胞均匀分布；将 6 孔板置于培养箱中培养，并定期观察细胞状态；待每个族

细胞量大于 100 个时终止培养；去除培养基，PBS 洗涤两次；向每孔中加入 1ml 的

多聚甲醛室温静置 30min 以固定细胞；去除多聚甲醛，PBS 洗涤两次后，每孔加入

1ml 的 0.1%结晶紫溶液，并于室温下静置 1h；回收结晶紫，用水充分洗涤细胞簇，

并于通风处晾干；6 孔板置于白纸上进行拍照，并计数细胞簇个数。