只需一文，吃透CRISPR/Cas9

国庆假期临近尾声，各位铁子也要收收心，继续奋斗自己的科研事业了。这里将自己这么多年来使用Cas9技术的经验做了个总结，能力有限，欢迎各位老铁留言反馈，共同学习和进步。

CRISPR/Cas9是最早被发现的Cas蛋白，也是目前发现的对DNA切割活性最高的Cas家族成员。随着科学家的不懈努力，越来越多的基因工程改造的Cas9突变体应运而生，目前基因工程改造的主要目的都在于制备出保真性更好、分子量更小的Cas9变体，以利于后续能在临床上对遗传性疾病开展基因治疗。今天开始我会跟大家聊聊大家怎样将CRISPR/Cas9技术融入自己的科研项目里，助力各位老铁发表更高分文章。

基于CRISPR/Cas9技术目前能开展的应用包括：基因敲除（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47167208 ）、点突变/外源基因敲入（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47172795 ）、基因激活和失活（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47178172 ）及单碱基编辑（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47185709 ），下面我讲详细阐述。

（1）基因敲除：基于Cas9基因敲除技术是最为大家耳熟能详的了，因为Cas9的发现本身就是作为细菌抵抗天敌入侵，以达到清除入侵病原基因组的一种天然免疫方式。因为Cas9蛋白对基因组DNA有很好的结合和切割能力，在sgRNA的引导下能对特定PAM区-3到-4核苷酸之间进行切割。利用这一特性，我们就可以对我们的目的基因进行敲除。一般的做法是利用在线网站（ https://sg.idtdna.com/pages ）对目的基因设计多条sgRNA，制备好质粒后，与Cas9质粒分别共转染293T细胞，通过PAGE方法判断sgRNA的切割效率，筛选到两条切割效率好sgRNA。再将Cas9质粒和两条sgRNA质粒共转染目的细胞，通过挑单克隆和pcr鉴定，筛选出两条sgRNA之间DNA完整删除的细胞克隆用于后续实验（图1）。目前也有利用Cas9蛋白进行全基因组筛选的，其方法就是通过制备全基因sgRNA文库，包装慢病毒后低MOI感染目的细胞，通过压力筛选和sgRNA测序，进而判断哪些基因敲除利于或不利于特定的压力筛选（图2）。

图1：基于CRISPR/Cas9的哺乳动物细胞基因敲除（Protein Cell. 2021 Aug;12(8):653-661. doi: 10.1007）。

图2：基于CRISPR/Cas9的全基因组文库筛选（Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7792. doi: 10.1126/sc）。

（2）点突变/外源基因敲入，哺乳动物细胞天然存在着一种同源重组修复(Homologous Recombination Repair, HR)机制，在一条DNA链发生断裂时，会以另一条完整的DNA链为模版对断裂的DNA进行修复。利用这一特性，结合Cas9能对DNA进行切割的特点，对特定细胞转染Cas9和sgRNA的同时，转入携带特点位点同源臂的点突变/外源基因的donor质粒，就能达到点突变/外源基因定点敲入的目的。这一技术在发育和遗传性疾病研究中应用比较多。在发育研究方面，可以在胚胎干细胞的特点基因后面敲入特定的标记基因，在分化发育过程中对特定细胞进行示踪（图3）；在遗传病方面，可以将临床发现的基因突变敲入到特定种类的细胞中，通过制备细胞模型去探究疾病发生的分子机制及基因治疗（图4）。

图3：一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用（专利号：CN202210836818.1）。

图4：基于Cas9同源重组修复的点突变和外源基因敲入（Stem Cell Res.doi: 10.1016/j.scr.2022.102842.）。

（3）基因激活或失活（CRISPRa和CRISPRi），研究证实spCas9蛋白的HNH结构域H840A突变和RuvC结构域D10A突变可以制备切割功能缺失的Cas9（deadCas9，dCas9）蛋白。这种“钝化”和“死亡”Cas9失去切割DNA的功能，但在sgRNA的引导下仍能以相同的精确度靶向和特点的结合DNA。利用这一特性，科学家将dCas9蛋白与特定的效应蛋白融合，将调控蛋白招募到基因组的特定位置，进而实现调控目的。（a）其中基于表达激活的CRISPRa系统是将dCas9与典型的转录激活因子如VP64、p65融合。该系统可以在多种真核细胞的全基因组范围内进行基因激活。随着研究的深入，科学家们还对该系统进行了优化，具体做法是对sgRNA是经修饰过的，使其可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这个新的dCas9-SAM系统的激活效率是旧系统的100倍左右。随后科学家也开发了第三代激活系统，dCas9-VPR，该系统由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，这大大简化了设计过程。当与sgRNA文库结合使用时，该系统还能够支持大规模的全基因组功能激活，使其成为研究生物学过程和途径的有力工具（图5）。（b）将dCas9与靶位点的结合在空间上可以干扰转录酶的结合，起到抑制靶向基因转录的作用，这一过程称为CRISPRi（或CRISPR干扰）。这个简单的CRISPRi系统可以高达1000倍抑制，有效敲低细胞中的基因表达。虽然这个系统在细菌、酵母和其他原核细胞中的表现相当好，但它在抑制哺乳动物细胞中的基因表达方面效果较差。因此科学家们开发了dCas9-KRAB系统，在这个系统中，dCas9与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB（Krüppel-associated box）融合。这种增强的CRISPRi系统依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子，通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达（图6）。

图5：基于dCas9的基于表达激活系统CRISPRa（PMID：34719304）。

图6：基于dCas9的基于表达抑制系统CRISPRi（PMID：34719304）。

（4）单碱基编辑，与上一节讲到的基于Cas9的基因表达激活和失活原理类似，基于Cas9的单碱基编辑技术也是利用到失活的Cas9再融合相应的核苷酸脱氢酶，利用sgRNA的靶向性携带dCas9-脱氢酶复合物到相应的位点对窗口内的靶点碱基进行编辑。2016年，David Liu教授团队在Nature杂志报道了首个单碱基编辑器，标志着基因编辑进入了单碱基编辑时代。该文章对不同的脱氨酶种类、融合位置及linker的选择进行优化，得到具备较好单碱基编辑能力的第一代编辑器rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI，实现了特定位点C>T的碱基转换（图7）。一年之后，该团队有开发了能实现A>G碱基转化的ABE碱基编辑器（图8）。在2019年，David Liu团队开发了能实现任意碱基转化的编辑器PE工。首先，团队基于nCas9（H840A）和逆转录酶构建融合蛋白，同时对sgRNA进行改造，得到第一代PE。之后该团队对逆转录酶进行工程化改造制备了第二代PE，提高了单碱基编辑效率。随后，又对断裂非编辑链进行改进，得到编辑效率更高的第三代PE。然而，目前绝大多数实验室复现的编辑效率很低，在一定程度限制了PE的应用。在2021年，David Liu教授与普林斯顿Adamson教授团队合作，开发出第四代与第五代PE系统，利用CRISPRi技术鉴定发现MMR通路能影响PE的编辑效率。团队发现共表达MLH1能显著提升PE编辑效率，随后对MLH1进行截短实验发现其MSH2 binding结构域发挥关键功能。最终，团队在PE2和PE3的基础上，共表达MLH1dn蛋白，能显著提升PE编辑效率，这样的系统被称为PE4和PE5（图9）。

图7：单碱基编辑器BE及其工作原理（PMID: 35189910）。

图8：单碱基编辑器ABE及其工作原理（PMID: 35189910）。

图9：单碱基编辑器PE及其工作原理（PMID：31634902）

碱基编辑器作为一项新型的基因编辑技术，备受基因编辑领域专家的关注，一直是研究的热点。该工具的面世填补了经典的Cas9技术无法涉及的领域空白。虽然BE，ABE和PE等碱基编辑器仍存在一定的弊端和瓶颈亟待突破，但是我相信在不久的将来通过科学家们的不懈努力，最终能制备出临床适用的单碱基编辑器，为遗传性疾病患者的基因治疗带来福音！

参考文献

[1]Liu J, Chen J, Zhong Y, Yu X, Lu P, Feng J, Zhang X, Ma S, Yang C, Yang B, Rong Z. OSMRβ mutants enhance basal keratinocyte differentiation via inactivation of the STAT5/KLF7 axis in PLCA patients. Protein Cell. 2021 Aug;12(8):653-661. doi: 10.1007/s13238-020-00818-3. 

[2]Xia F, Ma Y, Chen K, Duong B, Ahmed S, Atwal R, Philpott D, Ketela T, Pantea J, Lin S, Angers S, Kelley SO. Genome-wide in vivo screen of circulating tumor cells identifies SLIT2 as a regulator of metastasis. Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7792. doi: 10.1126/sciadv.abo7792. 

[3] 刘军.一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用. 2022.07.15，CN202210836818.1.

[4] Zheng W, Zhong Y, Yuan L, Yu X, Wang X, Yang C, Liu H, Lv P, Luo Y, Qiu B, Liu J, Yang B. Generation of a human embryonic stem cell line (SMUDHe010-A-82) carrying a homozygous c.1538G > A (p.G513D) mutation in the OSMR gene by CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination. Stem Cell Res. 2022 Aug;63:102842. doi: 10.1016/j.scr.2022.102842. 

[5] Zocca VFB, Corrêa GG, Lins MRDCR, deJesus VN, Tavares LF, Amorim LADS, Kundlatsch GE, Pedrolli DB.Bacillus subtilisThe CRISPR toolbox for the gram-positive model bacterium. Crit Rev Biotechnol 2022 Sep;42(6). DOI：10.1080/07388551.2021.1983516.

[6]Wang SW, Gao C, Zheng YM, Yi L, Lu JC, Huang XY, Cai JB, Zhang PF, Cui YH, Ke AW. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 2022 Feb 21;21(1):57. doi: 10.1186/s12943-022-01518-8.

[7]Anzalone AV, Randolph PB, Davis JR, Sousa AA, Koblan LW, Levy JM, Chen PJ, Wilson C, Newby GA, Raguram A, Liu DR. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019 Dec;576(7785):149-157. doi: 10.1038/s41586-019-1711-4.

[8]Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4. doi: 10.1038/nature17946.

[9]Gaudelli NM, Komor AC, Rees HA, Packer MS, Badran AH, Bryson DI, Liu DR. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471. doi: 10.1038/nature24644.