基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之基因激活和基因失活

咱们故事继续，第一节介绍了基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47167208 ）；第二节给大家分享了基于Cas9同源重组修复点的突变和外源基因敲入（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47172795 ），想要了解的同学自己点击链接查看，今天第三讲咱俩聊一聊基于dCas9的基因激活和基因失活。

（3）基因激活或失活（CRISPRa和CRISPRi），研究证实spCas9蛋白的HNH结构域H840A突变和RuvC结构域D10A突变可以制备切割功能缺失的Cas9（deadCas9，dCas9）蛋白。这种“钝化”和“死亡”Cas9失去切割DNA的功能，但在sgRNA的引导下仍能以相同的精确度靶向和特点的结合DNA。利用这一特性，科学家将dCas9蛋白与特定的效应蛋白融合，将调控蛋白招募到基因组的特定位置，进而实现调控目的。（a）其中基于表达激活的CRISPRa系统是将dCas9与典型的转录激活因子如VP64、p65融合。该系统可以在多种真核细胞的全基因组范围内进行基因激活。随着研究的深入，科学家们还对该系统进行了优化，具体做法是对sgRNA是经修饰过的，使其可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这个新的dCas9-SAM系统的激活效率是旧系统的100倍左右。随后科学家也开发了第三代激活系统，dCas9-VPR，该系统由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，这大大简化了设计过程。当与sgRNA文库结合使用时，该系统还能够支持大规模的全基因组功能激活，使其成为研究生物学过程和途径的有力工具（图1）。（b）将dCas9与靶位点的结合在空间上可以干扰转录酶的结合，起到抑制靶向基因转录的作用，这一过程称为CRISPRi（或CRISPR干扰）。这个简单的CRISPRi系统可以高达1000倍抑制，有效敲低细胞中的基因表达。虽然这个系统在细菌、酵母和其他原核细胞中的表现相当好，但它在抑制哺乳动物细胞中的基因表达方面效果较差。因此科学家们开发了dCas9-KRAB系统，在这个系统中，dCas9与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB（Krüppel-associated box）融合。这种增强的CRISPRi系统依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子，通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达（图2）。

图1：基于dCas9的基于表达激活系统CRISPRa（PMID：34719304）。

图2：基于dCas9的基于表达抑制系统CRISPRi（PMID：34719304）。

参考文献

[1] Zocca VFB, Corrêa GG, Lins MRDCR, deJesus VN, Tavares LF, Amorim LADS, Kundlatsch GE, Pedrolli DB.Bacillus subtilisThe CRISPR toolbox for the gram-positive model bacterium. Crit Rev Biotechnol 2022 Sep;42(6). DOI：10.1080/07388551.2021.1983516.