综述分享-单细胞测序技术在癌症免疫治疗领域的应用

今天和大家分享一篇于2021年4月在Journal: Nature reviews. Clinical Oncology上发表的一篇影响因子65.001的综述"Apply high-dimensionalsingle-cell technologies to analysis of cancer immunotherapy"。众所周知，免疫疗法在肿瘤的治疗中发挥着独特的优势，然而只有特定的一部分患者能从免疫疗法中获益，甚至少数患者在接受免疫疗法后出现疾病超进展的状态。单细胞测序的出现，为剖析肿瘤微环境、指导癌症免疫治疗、解释免疫疗法的抵抗性提供了强有力的帮助。本次分享的综述全面地介绍单细胞测序技术在肿瘤免疫治疗中的应用，让我们一起来学习一下吧！

一、背景

肿瘤是肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞的混合物，肿瘤微环境(TME)包括能够调节肿瘤生长并影响肿瘤进化的促肿瘤和抗肿瘤信号。传统的bulk sequence 是基于整体平均水平分析数据，对分析肿瘤组成有一定价值，但掩盖了特定细胞亚群的特征。然而，这些被忽略的细胞可能在肿瘤生长进展中发挥着至关重要的作用，单个细胞的基因组学、转录组学、表观基因组学和蛋白质组学检查克服了传统bulk sequencing的许多局限性，使癌症的细胞和分子基础得到更精确的解剖。

传统测序和单细胞测序对比

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目前单细胞方法为解答肿瘤免疫学中持续存在的问题提供了独特见解。包括:

1. 肿瘤和免疫细胞异质性(包括抗原呈递机制表达的异质性)的作用
2. T细胞克隆型和表型之间的关系
3. 存在于 TME 中的免疫检查点相互作用的网络
4. 肿瘤细胞和免疫细胞之间以及不同免疫细胞类型之间的空间功能关系

本篇文章首先论述单细胞转录组学、蛋白质组学、表观基因组学、基因组学各组学如何改变了我们对抗癌免疫治疗的反应性和抗性的理解，然后探索整合的多组学分析方法。此外，单独探讨单细胞T细胞受体(TCR)分析的重要性并且将单细胞空间分析应用于肿瘤免疫治疗。最后，文章讨论了单细胞技术的未来发展方向及其在肿瘤免疫学领域中可能发挥的作用。

二、单细胞组学

单细胞分析技术在肿瘤免疫学的工作流程

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1.单细胞转录组（scRNA-seq）

肿瘤细胞与免疫治疗反应：对不同肿瘤组织分析可以观察到，胶质瘤、黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌、卵巢癌中每个肿瘤都有各自独特的进化轨迹。对免疫和基质细胞的单细胞分析在鉴定患者间共享的免疫治疗反应相关的细胞类型和状态时更有成效。

免疫细胞与肿瘤免疫反应：全面理解免疫细胞组成和状态有助于解释免疫疗法的反应性和抗性，并且对于新型免疫调节疗法和组合的合理设计是至关重要的。相关单细胞转录组学研究证明肿瘤内主要是活化的CD8+T细胞，但不是功能性活化的CD4+T细胞。

细胞间相互作用：从scRNA-seq数据中可以推断不同细胞类型之间的配体-受体对的表达。为了更好地理解肿瘤细胞和TME细胞之间错综复杂的相互作用，还在探索开发细胞-细胞相互作用的新技术，包括具有空间分辨力的scRNA-seq 方法。

2. 单细胞蛋白组学

与RNA相比，蛋白质的半衰期更长，意味着蛋白质测量不容易受到在scRNA-seq 数据中经常观察到的波动的影响。抗体靶向方法提供额外的检测能力，如检测翻译后修饰或通过细胞形态测量评估形态学特征。新兴的单细胞蛋白质组分析技术包括：基于荧光的流式细胞术，不破坏细胞结构，因此能够在后续实验中对细胞进行分离和分类；条形码寡核苷酸代替荧光团或重金属离子标记抗体，消除了对同时可分辨靶标数量的限制。

3.单细胞基因组学

单细胞的全基因组和全外显子组测序方法已开发，但由于这种测序的高成本限制了临床应用。一种更有效的方法是首先对肿瘤DNA样本进行深度测序以识别体细胞突变，然后对单细胞DNA进行定向测序以精准检测假定的驱动突变或克隆结构中的突变。虽然尚未应用于免疫治疗，但该系统已用于分析成千上万的单细胞，通过诊断、缓解和复发来追踪急性髓系白血病患者的特定突变，从而证明了这项技术的前景。

4.表观遗传

ATAC-seq、基于亚硫酸氢盐的DNA甲基化测序、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和染色体构象捕获技术(3C和Hi-C)都已被用于单细胞分析，其中ATAC-seq具有高通量优势，目前被广泛使用。单细胞表观基因组学是一个快速发展的领域，特别是与单细胞转录组结合时，很可能成为肿瘤学中单细胞分析的下一个主要进展。

5.多组学

单细胞RNA+蛋白质组学可以提高评估TME的能力；单细胞DNA+蛋白质组学提供了连接基因型和表型的直接方法；谱系追踪：scATAC-seq能够同时测量细胞谱系(通过线粒体基因组)和细胞命运(通过核表观基因组)。可应用于了解哪些肿瘤细胞克隆响应特定的治疗而扩增或收缩，因此判断哪些克隆可能与治疗抗性有关。

三、单细胞TCR分析和高维空间分析

T细胞是负责抗肿瘤免疫的后天免疫系统的主要分支，大多数FDA批准的癌症免疫疗法(如 ICI，过继性细胞疗法，肽或RNA疫苗，基于细胞因子的疗法和溶瘤病毒疗法)都主要针对于T细胞。所以，单个T细胞克隆型的分析是目前的热点所在。

单细胞方法鉴定配对的α和βTCR亚基是确定浸润T细胞特异性的关键步骤。这些信息可能不仅有助于解释对当前免疫疗法的抗性(例如缺乏肿瘤特异性) ，而且还有助于发现可用于新型工程化TCR的细胞疗法的高亲和力抗肿瘤TCR。

肿瘤免疫微环境的空间变异性越来越被认为是导致大多数癌症类型的异质性和治疗反应变化的原因。高维蛋白质检测方法有可能将空间分析的多重能力提高到20-100个标记的水平，从而扩大可以表征的细胞类型和细胞状态的数量。这种增加的维度使得对单细胞表型网络之间复杂的空间相互作用的分析达到了前所未有的深度，从而在空间上定义了肿瘤和/或其微环境中的细胞“群体”，这可能是比单独定量单细胞表型更好的预后生物标志物。

高维空间分析揭示三级淋巴结构

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四、小结

单细胞RNA测序和相关模式正日益成为表征免疫治疗反应和耐药性的关键研究工具。单细胞TCR分析确定T细胞抗原特异性，并提供关于后天免疫系统在肿瘤形成、生长和治疗中的作用的重要信息。单细胞分析的下一个前沿领域是高维内容与精确组织定位的结合。高维单细胞分析的临床实用性包括鉴定免疫治疗反应的高维生物标志物，对大量测序数据进行精确分析，并理解TME中驱动对免疫治疗的反应的复杂细胞-细胞空间相互作用。

在临床免疫治疗中纳入单细胞分析

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原文转自：医学僧的科研日记(ID:zzudoctor)