基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之点突变/外源基因敲入

咱们故事继续，上一节介绍了基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术，想要了解的同学自己点击链接查看（ https://www.dxy.cn/bbs/newweb/pc/post/47167208 ），今天第二讲咱俩聊一聊基于Cas9的同源重组修复进行点突变和外源基因敲入。

（2）点突变/外源基因敲入，哺乳动物细胞天然存在着一种同源重组修复(Homologous Recombination Repair, HR)机制，在一条DNA链发生断裂时，会以另一条完整的DNA链为模版对断裂的DNA进行修复。利用这一特性，结合Cas9能对DNA进行切割的特点，对特定细胞转染Cas9和sgRNA的同时，转入携带特点位点同源臂的点突变/外源基因的donor质粒，就能达到点突变/外源基因定点敲入的目的。这一技术在发育和遗传性疾病研究中应用比较多。(I)在发育研究方面，可以在胚胎干细胞的特点基因后面敲入特定的标记基因，在分化发育过程中对特定细胞进行示踪（图1）；(II)在遗传病方面，可以将临床发现的基因突变敲入到特定种类的细胞中，通过制备细胞模型去探究疾病发生的分子机制及基因治疗（图2）。

图1：一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用（专利号：CN202210836818.1）。

图2：基于Cas9同源重组修复的点突变和外源基因敲入（Stem Cell Res.doi: 10.1016/j.scr.2022.102842.）。

参考文献

[1] 刘军.一种AAVS1:Brainbow敲入的人胚胎干细胞系及其构建方法与应用. 2022.07.15，CN202210836818.1.

[2] Zheng W, Zhong Y, Yuan L, Yu X, Wang X, Yang C, Liu H, Lv P, Luo Y, Qiu B, Liu J, Yang B. Generation of a human embryonic stem cell line (SMUDHe010-A-82) carrying a homozygous c.1538G > A (p.G513D) mutation in the OSMR gene by CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination. Stem Cell Res. 2022 Aug;63:102842. doi: 10.1016/j.scr.2022.102842.