基于CRISPR/Cas9我们在实验室能做些什么？——系列之基因敲除

CRISPR/Cas9是最早被发现的Cas蛋白，也是目前发现的对DNA切割活性最高的Cas家族成员。随着科学家的不懈努力，越来越多的基因工程改造的Cas9突变体应运而生，目前基因工程改造的主要目的都在于制备出保真性更好、分子量更小的Cas9变体，以利于后续能在临床上对遗传性疾病开展基因治疗。今天开始我会分章节跟大家聊聊基于CRISPR/Cas9，我们在实验室能做些什么实验。

（1）基因敲除：基于Cas9基因敲除技术是最为大家耳熟能详的了，因为Cas9的发现本身就是作为细菌抵抗天敌入侵，以达到清除入侵病原基因组的一种天然免疫方式。因为Cas9蛋白对基因组DNA有很好的结合和切割能力，在sgRNA的引导下能对特定PAM区-3到-4核苷酸之间进行切割。利用这一特性，我们就可以对我们的目的基因进行敲除。一般的做法是利用在线网站（ https://sg.idtdna.com/pages ）对目的基因设计多条sgRNA，制备好质粒后，与Cas9质粒分别共转染293T细胞，通过PAGE方法判断sgRNA的切割效率，筛选到两条切割效率好sgRNA。再将Cas9质粒和两条sgRNA质粒共转染目的细胞，通过挑单克隆和pcr鉴定，筛选出两条sgRNA之间DNA完整删除的细胞克隆用于后续实验（图1）。目前也有利用Cas9蛋白进行全基因组筛选的，其方法就是通过制备全基因sgRNA文库，包装慢病毒后低MOI感染目的细胞，通过压力筛选和sgRNA测序，进而判断哪些基因敲除利于或不利于特定的压力筛选（图2）。

图1：基于CRISPR/Cas9的哺乳动物细胞基因敲除（Protein Cell. 2021 Aug;12(8):653-661. doi: 10.1007）。

图2：基于CRISPR/Cas9的全基因组文库筛选（Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7792. doi: 10.1126/sc）。

参考文献

[1]Liu J, Chen J, Zhong Y, Yu X, Lu P, Feng J, Zhang X, Ma S, Yang C, Yang B, Rong Z. OSMRβ mutants enhance basal keratinocyte differentiation via inactivation of the STAT5/KLF7 axis in PLCA patients. Protein Cell. 2021 Aug;12(8):653-661. doi: 10.1007/s13238-020-00818-3. 

[2]Xia F, Ma Y, Chen K, Duong B, Ahmed S, Atwal R, Philpott D, Ketela T, Pantea J, Lin S, Angers S, Kelley SO. Genome-wide in vivo screen of circulating tumor cells identifies SLIT2 as a regulator of metastasis. Sci Adv. 2022 Sep 2;8(35):eabo7792. doi: 10.1126/sciadv.abo7792.