预测结直肠癌的生存和免疫微环境：一个与STAT信号相关的信号

今天和大家分享一篇于2022年7月在An International Journal of Medicine上发表的一篇影响因子14.04的干湿结合的文章"Predicting survival and immune microenvironment in colorectal cancer: a STAT signaling-related signature"。作者从数据库中提取CRC患者的基因表达和临床谱。使用具有预后价值的差异表达基因来构建一个STAT相关的签名。通过单样本基因集富集和细胞分类分析进一步评估免疫细胞的浸润和组成。实验验证了hub基因Caveolin-1（CAV1）对细胞增殖、凋亡、衰老和肿瘤血管生成的影响。

一、背景

1.结直肠癌（CRC）成为第三大最常见的恶性肿瘤，威胁着公共卫生。由于基因组学、转录组学、蛋白质组学和表观基因组学数据的贡献，靶向治疗正在成为一种新的选择，但与传统治疗相比仍处于起步阶段。因此，需要开发新的生物标志物和靶向治疗的有前途的候选药物。

2. 信号转换器和转录激活因子（STAT）信号在肿瘤细胞和微环境中癌症的发生发展中都是必不可少的。STAT蛋白作为一种转录因子，主要通过刺激激活酪氨酸和丝氨酸残基的直接磷酸化，并介导各种下游信号通路的激活。

3. 尽管STAT在大多数癌症类型中的作用已经得到了充分的研究，但STAT信号通路，包括其在CRC中的调节因子和效应因子，在很大程度上仍然是未知的。

二、方法

研究队列：530例CRC患者的数据，包括rna测序（RNA-seq）和相应的临床数据。175个STAT信号相关基因通过STAT的受体信号通路鉴定得到。

(1)差异分析通过“limma”包在STAT信号相关基因中选择CRC与正常样本之间的差异表达基因（DEGs）。

(2) 预后基因特征的构建采用单因素Cox回归模型评价DEGs的预测值，用LASSO Cox回归分析构建特征。并使用(ROC)曲线和曲线下面积(AUC)来评估基因签名的准确性。

(3) 功能富集分析使用“clusterProfiler”包进行了GO和KEGG通路富集分析。

(4) 免疫细胞浸润分析利用TIMER数据库分析预后基因与免疫细胞浸润之间的关系。此外，采用单样本基因集富集分析ssGSEA对16种免疫细胞和13种免疫相关通路的浸润性评分进行了评估。我们使用 CIBERSORT算法进一步评估了22种免疫细胞类型组成的差异。

(5)细胞系和培养采纳正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460和CRC细胞系HT29、HCT116和SW480。细胞在添加10%胎牛血清的杜尔贝尔培养基改良鹰培养基中培养，并在5%二氧化碳在37°C孵育。

(6)流量细胞计数法采用碘化丙啶（PI）染色和Annexin V-PI染色分别评价细胞周期的改变和细胞凋亡。离心后，用PI或Annixen VFITC或InnexinV-PI染色。流式细胞术使用FACSAria II细胞分选仪进行。细胞周期数据采用MODFIT软件进行分析，细胞凋亡数据采用FLOWJO软件进行分析。

(7) 免疫荧光使用PCNA细胞增殖试剂盒、TUNEL染色试剂盒和SA-bGal检测试剂盒进行免疫荧光染色。

(8)酶联免疫吸附试验（ELISA）血管生成素（ANG）、血小板源性生长因子-BB（PDGF-BB）、血管内皮生长因子（VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）水平由相应的ELISA试剂盒测定。

(9)内皮细胞管形成实验将SW480细胞接种于含有2 ml DMEM培养基的6孔板的孔中。72 h后收集SW480细胞的条件培养基，进行试管形成实验。在96孔板的孔上涂上基质和人脐静脉内皮细胞接种到每个孔中，并与来自SW480细胞的条件培养基孵育6小时。用尼康Ti-E显微镜观察管状结构，并计算完整的管状结构的数量。

三、结果

1.DEGS的鉴定和预后特征模型的构建

通过评估了TCGA队列中CRC患者的RNA-seq数据，鉴定与STAT信号相关的DEGs（P < 0.001，log2FC > 1），共鉴定出35个DEG。采用单因素Cox回归分析，评估CRC中各DEG的预后价值。随后，根据P值和Lasso Cox回归分析，进一步选择，构建了5个基因的STAT信号相关签名。预后特征的公式如下：0.009*CAV1+2.236*EPO+(-0.600)*IL13+0.116*LEP+0.059*NEUROD1

图 1​

根据中位风险评分分为低危组和高危组。患者的临床病理特征见图1A。风险评分和生存时间的分布情况如图1B所示。Kaplan-Meier生存曲线显示，风险评分较高的患者的生存率比风险评分较低的患者更差（P<0.001）（图1C）。3年和5年生存率的AUC值分别为0.644和0.668（图1D和E）。单因素Cox回归分析显示，风险评分与OS显著相关（图1F）。多因素Cox回归分析显示，风险评分可独立预测CRC患者的预后（图1G）。

2. 预后特征模型的验证

使用GSE14333数据集验证特征模型。风险评分和生存时间的分布情况如图2A所示。与低风险组患者相比，风险评分较高的患者生存率明显也较差（图2B）（P < 0.0001）。风险评分与患者的生存率显著相关（图2C），通过多因素Cox回归分析，这是一个独立的预测因素（图2D）。列线图的预测值为通过校准曲线进行验证（图2E)。与接受所有治疗的患者或无治疗的方案相比，列线图提供了更好的预后价值（图2F）。列线图的ROC曲线的AUC值分别为0.686和0.750（图2G和H）。

图 2​

3. 功能富集分析

通过GO通路分析，与DEGs显著相关的通路集中在免疫相关通路，包括免疫效应过程的调节、淋巴细胞介导的免疫、各种免疫反应等（图3A）。在KEGG通路分析中，细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路的异常调控最为显著（图3B）。

​图 3

4. 预后特征模型的免疫分析

通过TIMER数据库评估特征模型中的每个基因与免疫浸润的关联。在这5个基因中，CAV1与CRC中B细胞、CD8T细胞、CD4T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞浸润显著相关（图3C）。在ssGSEA评分中，与风险评分较低的患者相比，风险评分较高的患者免疫细胞浸润明显较低（图3D），免疫相关通路下调（图3E）。此外，采用CIBERSORT算法评价浸润免疫细胞的组成。肿瘤微环境细胞组成的概述如图3F所示。在低危组和高危组中，激活的CD4记忆T细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、滤泡辅助T细胞和M0巨噬细胞的浸润水平存在显著差异（图3G和H）。22种免疫细胞的相关性研究表明，M0巨噬细胞与静息树突状细胞、静息肥大细胞和CD8T细胞呈负相关。此外，静息状态下的肥大细胞与活化的肥大细胞呈负相关（图3I）。

图 4​

5. CAV1可抑制CRC细胞的增殖，诱导细胞凋亡和衰老

在SW480细胞中过表达CAV1（图4C），进一步评估其细胞功能。如图4D所示，采用增殖细胞核抗原（PCNA）染色法评价CRC细胞的增殖情况，结果显示过表达CAV1显著降低了SW480细胞的增殖情况。过表达CAV1后，S期细胞比例下降（图4E）。此外，TUNEL染色显示，CAV1过表达也可诱导SW480细胞凋亡（图4F）。图4G显示，过表达CAV1条件下，凋亡细胞比例显著增加（图4G）。此外，过表达CAV1的细胞中与衰老相关的b-半乳糖苷酶（SA-b-gal）染色更为阳性（图5A）。在过表达cav1的SW480细胞中，细胞衰老的标记物p16和p21明显增加（图5B）。

图 5​

6. CAV1可抑制结直肠癌的肿瘤血管生成

观察CAV1对结直肠癌肿瘤血管生成的影响。与转染了空载体的SW480细胞的条件培养基相比，过表达CAV1细胞的条件培养基显著抑制了HUVEC管的形成（图5C）。ELISA进一步表明，过表达CAV1时，SW480细胞产生的ANG和PDGF-BB数量增加，而VEGF和HGF的产生与对照组细胞相比没有显著差异（图5D）。

四、小结

本研究的干湿结合分析思路非常简单明了，可操作性很强。作者构建了一个新的与STAT信号相关的基因签名和列线图，用于预测CRC患者的预后。发现该签名为STAT信号参与癌变和肿瘤免疫微环境的调控，提供了关键信息：CAV1的下调至少部分归因于CRC的发展。然后通过一系列的实验来进行验证并发现CAV1可抑制CRC细胞的增殖，诱导细胞凋亡和衰老，可抑制结直肠癌的肿瘤血管生成。未来的研究也可以进一步探讨CAV1具体的机制和调控模式。

原文转自：医学僧的科研日记(ID:zzudoctor)