化合物手性异构体杂质分析方法开发及控制策略

药物的不同手性异构体有不同的药理作用和毒理作用，例如D-苯异丙胺是一种十分有效的中枢神经兴奋剂，而其异构体则几乎没有药效；著名的“反应停”事件的（R）-（+）-沙利度胺具有镇静和安眠作用，（S）-（-）-对映体对胎儿有致畸作用。所以对于含手性的化学药物而言，除非有足够的药理、毒理研究工作证明互为手性异构体的化合物的药理、毒理作用相同，否则手性异构体杂质的控制是非常重要的质量研究工作。

一、分析方法开发

目前主流的手性分析方法开发主要依赖于市场上类型丰富的手性色谱柱。手性分离机制较为复杂，大体可分为：过渡金属配合物、电荷转移作用（π-π作用）、极性作用（氢键、偶极）、包合作用等。由于手性分离往往受多种作用机制共同作用，不同化学性质的异构体需要采用不同类型的手性柱，且市场上发展出的手性色谱柱种类繁多，迄今为止没有一款手性色谱柱像C18一样普遍适用，较为经典的为大赛璐的“四大金刚”（AD-H、AS-H、OD-H、OJ-H）。

1、文献查阅

方法开发初期，文献的查阅非常必要，包括药典、期刊、数据库、专利、进口注册标准等。文献查询方式多种多样，知网、万方、维普这类中文数据库的文献查询笔者在此不做赘述。在此主要介绍外文数据库中使用较为普遍、也较为强大的化学数据库Scifinder的使用。在Scifinder中画出待测化合物的手性结构，查询该手性化合物的合成路线文献，将查阅到的文献下载下来。以两篇JOC文献为例，在“EXPERIMENTAL SECTION”部分的资料中，除了会包含该手性化合物的核磁、晶型、红外、熔点、质谱等信息外，还会提供该手性化合物的手性分离信息（见下图）。若无法直接查询到目标物，则查阅相似结构的文献作为参考开始色谱柱筛选工作。

此外市场上许多色谱柱厂家或代理商建有色谱柱应用数据库，有些则以应用手册形式存在，这种需要跟厂家沟通提供。以下为笔者收集的一些手性色谱柱的数据库查询网址：

大赛璐： https://search.daicelchiral.com/

Regis： https://www.registech.com/chiral-applications/#letter-A

菲罗门： http://www.gzflm.com/index.aspx?lanmuid=88&sublanmuid=834

YMC： http://www.ymcsepu.com/c_seputu/

广州研创： https://www.chiral-se.com/imgtxt-57143-50232.html

Agilent： http://navigator.chem.agilent.com/products/select/option/

（注:安捷伦这个不是数据库，只是会提供一个针对性的色谱柱推荐功能）

2、检测系统及色谱柱筛选

若实在没有文献可参考，则首先根据化合物结构优先确定检测系统，下表为笔者简单整理的一个选择表供同行参考。

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色谱柱筛选时建议供试品浓度先不宜过高，先考虑分离问题，再考虑灵敏度问题。先以企业自有的手性柱进行尝试，普通化合物建议从大赛璐的“四大金刚”开始，从笔者个人方法开发经验而言，“四大金刚”的适用率非常高。各手性色谱柱公司基本都有自己的手性色谱柱选择指南，在各公司官网或者找销售都可以获得，根据指南进行色谱柱筛选，也可以直接找色谱柱厂家的技术人员推荐色谱柱。

市场上大多数设立有实验室的手性色谱柱公司，如大赛璐、菲罗门、安捷伦等，均会免费接收含1-2个手性中心的化合物的手性色谱柱筛选工作，主要模式是外寄样品交由手性色谱柱公司进行色谱柱筛选，色谱柱公司免费提供色谱柱筛选工作，再向企业销售色谱柱。将样品寄给色谱柱公司进行色谱柱筛选可以很好提高方法开发效率。但通常色谱柱厂家的这类筛选工作只会考虑分离问题，不会考虑灵敏度问题，色谱柱公司实验室进行色谱柱筛选的供试品浓度通常不会太高，且厂家的色谱柱由于应用的化合物范围非常广，药企购买来的色谱柱的重现性没有那么好，通常条件下还是需要药企做进一步优化。当然，若化合物手性中心较多，一些公司也会接手付费模式的方法开发。

市场上相较液相手性色谱柱，气相手性色谱柱的种类相对少一些，主流固定相主要为环糊精，但厂家较多，如安捷伦、Macherey Nagel、默克等可供选择。

3、方法的进一步优化

筛选到最优分离的色谱柱的情况下，进一步则是考虑灵敏度问题。根据灵敏度要求将主成分浓度进一步提高后，有两种情况：

一、本身色谱柱对化合物的分离度就非常大，直接提高供试品浓度也满足分离度要求，这种方法基本不需要再过多进行优化，顶多稍微调整一下流速、添加剂、流动相等改善一下峰形，方法优化工作非常简单；

二、低浓度下可以分离，但是当供试品浓度提高后无法满足分离要求（即出现色谱峰叠加），这种情况是本文要着重探讨的情况。下表提供了几种解决方案供同行探讨。

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分离富集说明：分离富集方法的本质通过色谱柱对主成分和杂质实现一定分离，使富集溶液中主成分浓度降低从而达到分离检测目的。如下图，假定RT 7.5min杂质为难分开的手性异构体杂质，RT7.2min为主成分，这种情况其实当主成分浓度降低时，主成分和异构体是可以分离的。基于灵敏度浓度配置1份高浓度供试品溶液，例如假定进样10μl时的LOQ浓度约1μg/ml，按报告限0.05%折算供试品浓度最低要求2mg/ml，则可以：

①提高供试品浓度为4mg/ml（或更高），进样量为100µl，根据出峰时间（例如保留时间±1~2min开始）将过色谱柱和检测器后的流出液接取至2ml量瓶，接取开始时间和结束时间的确定因为不同品牌仪器的管路差异、品种不同的进样量需要自行根据品种进行试验确定，接样流速降低（接样流速降低，例如0.2ml/min方便操作，可以在方法梯度里面设，也可以一针一针接，手动操作）。接取液不足2ml以流动相比例补足至刻度即可。然后再以相同色谱条件进100μl检测分析，此时样品中的主成分浓度极大降低，便可以实现杂质分离检测；

②是供试品提高浓度直接进100μl，接取流出液后通过旋蒸方式除去溶剂浓缩后再精密复溶，只要满足杂质的灵敏度即可，实验设计方式可以多种多样。

二、控制策略

1-2个手性中心还能较易通过市场主流的手性色谱柱完全实现分离，但3个及以上手性中心的化合物，通常要实现所有手性异构体及主成分的互相分离有较大难度。如果通过色谱条件的调整可以直接实现多个手性化合物和主成分的互相分离，这当然是最优解。但是如果无法实现，则可以考虑改变杂质控制策略。笔者个人认为的策略优先级是：

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多个手性异构体杂质与主成分的分离，杂质之间可能互相重叠。下图为一含3个手性中心的化合物的手性分离谱图，加主成分共8个结构。经过各种尝试较难实现8个结构的完全分离，最终采取策略2。首先方法开发要实现7个手性异构体杂质与主成分的有效分离；26.043min的手性异构体为实际工艺产生的杂质，所以优先保证该杂质的检测不受干扰；13~19min的杂质多批次样品累积数据均未检出，所以13~15min的三个杂质合并控制，但杂质限度不能叠加，如各杂质分开测定的限度为0.1%，多个杂质叠加在一起后仍然按0.1%的限度控制，本质上质量控制更加严格。

当然如果上图1中14min左右的杂质才是工艺产生杂质或降解杂质，与13min和15min的杂质叠加后超过限度要求，则考虑策略3，与合成部门进行沟通，工艺较易清除的杂质，则从工艺上实现超限杂质的清除。工艺实在较难清除，则考虑策略4，尝试拆分多个分析方法针对不同杂质进行控制。如一个含4个手性中心的化合物，有16个构型，尝试多种方式均无法实现在一个色谱条件下完成16个构型的分离检测，后拆分成两个分析方法分别控制不同的异构体。以反相方法控制14个非对映异构体（如下图1，反相条件下互为对映异构体的两个结构保留时间一致），以正相方法控制对映异构体（如下图3）。通常来说，非对映异构体和主成分大多数都较易在反相普通C18色谱条件下就实现分离，若普通C18无法完全实现分离，还可以尝试对异构体有较优分离效果的PFP、ADME等色谱柱。通过强降解、影响因素、工艺分析等判断出哪些非对映异构体未检出，在此基础上进行对映异构的方法开发：需实现对映异构体与主成分分离、检出的非对映异构体不干扰对映异构体的检测。值得注意的是对映异构的检测方法中因为非对映异构体在反相条件下进行了控制，所以哪怕非对映异构和主成分重叠、未检出的非对映异构体的出峰位置与对映异构体重合也无所谓。

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如果通过多个色谱分析方法仍然无法实现所有异构体的控制，则考虑在合成工艺各步分别对构型进行控制，即策略5。根据强有力的理论分析，仅在终产品中对较大可能产生的构型进行控制，这种控制思路在多肽化合物、天然产物、多手性中心化合物等的合成控制中较为常用。如阿斯利康原研的替格瑞洛，有6个手性中心，直接建立分析方法控制63个异构体杂质较难，其手性异构体控制就是从源头起始物料进行控制，通过风险分析最终仅对7个可能存在的异构体进行控制。该种控制方式需要进行基于风险控制的理论分析，依据理论分析制定风险评估报告及杂质分步控制策略。

三、结语

本文方法开发思路主要围绕目前主流的手性色谱柱方法展开讨论，若实在遇到手性色谱柱无法解决的问题，手性试剂方法开发可以是一个尝试方向，只是根据经验个人认为这类分析方法不太好用，有兴趣的同行可以自行查阅文献了解。此外，对于非对映异构体，前文提过的核磁氢谱可以作为方法开发的一个尝试方向。互为非对映异构的化合物在核磁氢谱上表现出的化学位移通常有差异，在核磁图谱中找到分离开的特征氢出峰，通过Dr值对非对映异构进行控制。另外利用酶或微生物对某些对映体具有专一识别能力的特征，以效价方式考察，可以作为一种方法开发思路，不过这种方法局限性较大，建议主要以查文献参考为主，有文献方法可以尝试一下。