无缝克隆连不上不知道问题在哪

用的维诺赞的C112无缝克隆试剂盒，不太清楚问题出在哪了，载体酶切胶回收浓度28ng/ul，片段特意条带柱回收33.8ng/ul，按说明书用的1:2比例（0.03:0.06pmol），37度pcr仪反应30min，冰上冷却就转化了，用的takara的DH5a，冰浴30min，45s热激，冰浴2min，无抗soc摇1h，5000rpm离心5min，留100ul重悬涂板。

最后没有一个克隆长出来。

设计的引物F端的15bp同源臂GC含量高一点有67%，R端刚好40%，不知道是不是问题在这，或者说感受态转化效率的问题，把热激时间提高到90s？或者说把重组时间提高到1h？

再或者说重新设计F端同源臂，我看了22bp的同源臂才是低于60%GC，但是说明书推荐说同源臂15-20bp，40-60%GC，所以也很纠结