动物造模 | 小鼠急性肺损伤模型的制备

急性肺损伤( ALI) 是由于肺内外致病因素造成弥漫性炎性肺泡浸润、出血、肺水肿和透明膜形成，患者血氧结合能力降低为主的危急症候，严重者发展为急性呼吸窘迫综合征 。

在过去的二十年里，已经开发了几种治疗策略，并取得了显著的进展；然而，死亡率仍然很高，超过三分之一的患者死亡，一些幸存者由于长期低氧而出现脑损伤等并发症。目前 ALI 的病死率仍相当高，为 29%~42%，且与致病因素有很大关系；败血症的病死率约为43%，肺炎和误吸的病死率分别为 36%和37%，重大创伤则为11%。

研究发现强烈的炎症反应和肺泡毛细血管膜通透性增加在急性肺损伤的病理生理机制中起重要作用。制备稳定的动物模型对观察ALl 病理改变和探究潜在药物作用机制和防治并发症等具有重要意义。

目前关于 ALI 模型制备途径主要分为原发诱导和继发诱导两种。原发诱导通过向气管内滴注脂多糖( LPS) 、盐酸、活的( 或热杀死) 细菌和病毒等物质直接诱导肺部损伤，而继发诱导则是由其他疾病诱发ALI 包括烧伤、腹腔注射 LPS、盲肠结扎穿刺等。脂多糖刺激已被广泛认为是通过致炎建立与临床相关的 ALI 动物模型的有效策略。LPS诱导的 ALI 动物模型肺部炎性细胞聚集、肺泡毛细血管通透性增加导致弥漫性肺水 肿、肺出血等症。

发病机制

ALI 及更严重的 ARDS 是临床危重症发生急性呼吸衰竭的主要原因，其发病原因多样，可将其病因归类为两类，包括肺内因素和肺外因素，肺内因素包括：（1）化学性因素，如吸入烟尘、纳米颗粒及氧中毒等；（2）物理性因素，如肺挫伤及放射性损伤等；（3）生物性因素，如重症肺炎。肺外因素包括严重休克、感染中毒症、严重非胸部创伤、重度烧伤、大量输血、急性胰腺炎及药物中毒等，其中感染占主要地位。目前，ALI 的发病机制尚未阐明，当前的主流学说有：炎症反应介导学说、凝血和纤溶失衡学说、氧化还原失衡学说、细胞凋亡学说以及水通道和遗传等多个层面的学说。目前大多学者较认同的核心理论是炎症反应失控和氧化应激损伤，当肺泡上皮细胞因外伤直接损伤后，激活肺泡巨噬细胞炎症反应链，导致肺内炎症反应；间接肺损伤的因素是：肺外炎性介质通过循环系统进入肺内，肺作为全身炎症反应的靶器官再一次加重损伤。该反应为全身系统性炎症反应，反应过程中富含蛋白质的水肿液进入肺泡，导致肺泡上皮微血管的通透性增加，最终引起 ARDS，进而导致死亡。

脂多糖( LPS) 气管滴注法模型制备

选用 6-8周龄雄性小鼠，腹腔注射麻醉药物后将小鼠固定于解剖台上，沿颈正中线手术暴露气管，采用气管插管的方式向小鼠气管内滴注 LPS( 3mg / kg) ，气管滴注后将小鼠直立，垂直旋转小鼠，使药物能在小鼠肺部均匀布散，急性肺损伤模型即制备成功。

评估方法

病理学评估

病理学评估病理学观察是判定肺损伤程度的金标准。优点在于取样简单，观察评估简便准确；缺点在于只能将动物处死后取材，可能因为肺损伤后活体动物的病理表现存在一定的差异。模拟 ALI的动物模型实验基本用此种方法，步骤为：处死动物后将肺取出，利用石蜡制片及苏木精‒伊红染色（H-E staining） 法将肺组织切片固定染色，在光学显微镜下观察。肺损伤组的肺组织病理学表现为肺泡间质性水肿、肺泡壁厚度增加、中性粒细胞数量增多、肺组织斑块状出血。其病理学表现随损伤程度加重而更加明显。

炎性介质浓度评估

支 气 管 肺 泡 灌 洗 液 （BALF） 以及血清中炎性介质含量是除病理学外用到最多的评估肺损伤严重程度的方法。通过重复注射及回抽PBS缓冲液收集BALF，或者直接留取血清样品进行测定。在经过离心固定等操作后进行巨噬细胞及中性粒细胞计数，通过酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹法分析 IL-1β、NLRP3、NF-κB等指标的浓度，以及通过蛋白电泳等方法计算蛋白质浓度。

据文献报道，肺损伤严重程度与各种炎性介质如巨噬细胞、中性粒细胞、细胞因子计数密切相关。多种实验也证实，在 ALI 时中性粒细胞及巨噬细胞募集增多，在伤后 48 h后最为敏感；各种炎症因子如 IL-1β、NLRP3、NF-κB、HIF-1α、TNF-α等均有不同程度的升高，其中尤以 IL-1β最为敏感；而肺泡细胞相关蛋白质浓度也可以作为评估肺损伤程度的指标。

肺干/湿比

肺干/湿比（dry/wet ratio）可以用来评估肺水肿的严重程度。方法为：动物死亡时取全肺称重，确定湿重；置于烘箱中烘干后称重，确定干重；计算干/湿比。肺水肿是肺损伤时的重要表现之一，肺损伤组的肺干/湿比显著降低，且肺损伤程度越高，肺干/湿比越低。

血气分析

由于肺损伤时通气血流比例失衡，氧结合能力下降，动脉血氧分压下降，因此血气分析 （BGA）可以作为评估肺损伤程度的重要指标。在肺损伤时，动脉血氧分压可有不同程度的下降。但其结果受影响因素较多，因此只能作为参考而不是诊断的指标。

小结

ALI 动物模型是了解其主要发病机制及探索治疗方法的重要手段，人类研究中产生的假设可以在动物模型中进行测试，也可应用于评估动物与人体疾病之间的联系。但仍需要不断改进 ALI 的实验模型，尽可能同时复制出与临 床实际情况相同的 ALI 模型，对未来研究 ALI 的发病机制、病理改变、早期防治以及防治机制具有重要意义。