制作高质量染色切片，这些细节你要知道！

制作高质量染色切片，这些细节你要知道！

不管你是每天被组会和数据逼得无线自我怀疑的研究僧,还是刚刚要进入科研实验室的准小白,还是已经是实验室扛把子的资深科研工作者,甚至你只是例行体检,看过医生给自己的体检报告,你都会听到看过这样的字眼,病理,染色。染色的方法千千万,今天,小编就帮大家复习一下,最最常规的HE染色方法。

苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法,简称HE染色方法,是常规病理制片最基本的染色,能够对正常组织和病理组织进行形态结构的观察。

一、实验原理

1、细胞核染色的原理:苏木精为碱性天然染料,可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA,在DNA的双螺旋结构中,两条核苷酸链上的磷酸基向外,使DNA双螺旋的外侧带负电荷,呈酸性,很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,所以细胞核被染成蓝色。

2、细胞浆染色的原理:伊红是一种化学合成的酸性染料,在一定条件下可使细胞浆着色。细胞浆的主要成分是蛋白质,为两性化合物,细胞浆的染色与染液的pH在胞浆蛋白质等电点(4.7—5.0)以下时,胞浆蛋白质以碱式电离,则细胞浆带正电荷,就可被带负电荷的酸性染料染色。伊红在水中离解成带负电荷的阴离子,与胞浆蛋白质带正电荷的阳离子结合,使细胞浆着色,呈现红色。

3、分化作用:染色后,用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去,这个过程称为分化作用,所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液,因酸能破坏苏木精的醌型结构,使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后,必须用0.5%盐酸乙醇分化,使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去,在进行伊红染色,才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此,在HE染色中分化是极为关键的一步。

4、返蓝作用:分化之后,苏木精在酸性条件下处于红色离子状态,呈红色,在碱性条件下处于蓝色离子状态,呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色,故分化之后,立即用水出去组织切片上的酸而终止分化,再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核呈现蓝色,这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝,但所需时间较长。

二、实验材料和试剂:

1、苏木精染液:

苏木精染液配制方法有多种,Harris苏木精染液是最常用的一种,其配方如下:

苏木精:2g

无水乙醇:20ml

硫酸铝钾:20g

蒸馏水:200ml

氧化汞:0.5g

冰醋酸:8ml

配制步骤:先用无水乙醇溶解苏木精,用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,再将这两种液体混合后煮沸(约1min),离火后向该混合液中迅速加入氧化汞,并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色(此时有大量气泡产生,故容器宜大,以防液体溢出),随即用冷水冷却至室温,然后加入冰醋酸并混匀,过滤后使用。

2、伊红染液

伊红染液有是水溶性和醇溶性两种,常用的为0.5%水溶性伊红染液,其配方如下:

伊红Y:0.5g

95%乙醇:100ml

3、0.5%盐酸乙醇分化液

36%—38%盐酸:0.5ml

75%乙醇:99.5ml

4、0.2%氨水(pH在7.5—8之间)

25%—28%氨水:0.2ml

蒸馏水:100ml

三、染色步骤与方法:

1、烤片:60分钟,温度60℃(目的:使组织切片与载玻片贴合的更加紧密)

2、切片脱蜡至水:

    (1)二甲苯Ⅰ:10min

   (2)二甲苯Ⅱ:10min

   (3)二甲苯Ⅲ:10min

(4)无水乙醇Ⅰ:3-5min

    (5)无水乙醇Ⅱ:3-5min

   (6)95%乙醇Ⅰ:3-5min

  (7)90%乙醇:3-5min

    (8)80%乙醇:3-5min

   (9)75%乙醇:3-5min

(10)蒸馏水洗:5min

3、染色:

(1)木精染色:5-10min

   (2)蒸馏水洗:1min

(3)0.5%盐酸乙醇分化:10s/10 to 20 quick dips

(4)蒸馏水洗:2min

(5)0.2%氨水返蓝:约40s

(6)蒸馏水洗:2×1min

(7)0.5%伊红染色:5min

(8)蒸馏水速洗

4、脱水、透明、封固

   (1)80%乙醇:3min

   (2)90%乙醇:3min

    (3) 95%乙醇:3min

    (4) 无水乙醇Ⅰ:5min

   (5) 无水乙醇Ⅱ:5min

   (6) 二甲苯Ⅰ:5min

   (7) 二甲苯Ⅱ:5min

    (8) 二甲苯Ⅲ:5min

   (9) 中性树胶封固

四、染色结果

细胞核呈蓝色,细胞浆呈粉红色至桃红色,胶原纤维呈淡粉红色,红细胞呈较鲜艳的橘红色。钙盐、细菌菌落呈蓝色或紫蓝色。

五、注意事项

1、染色前,切片脱蜡应彻底。若脱蜡不彻底,则影响着色。

2、染色时间与染液的新旧程度有关,不能一成不变。新配制的染液着色力较强,染色时间可适当缩短;反之,则适当延长。伊红染色程度应以苏木精对核的着色程度为参照标准,掌握其染色时间,以达到对比鲜明为宜。

3、伊红染液的pH值不能低于细胞核染色体等电点(pI=3.3),否则染色体也可表现碱式电离带正电荷,而被伊红染液染色,使细胞浆与细胞核区分不开。因此伊红染液的pH值应小于胞浆蛋白等电点,而大于胞核染色体等电点,在3.6-4.7之间。

4、掌握好分化程度,分化时要认真观察,精心操作,观察切片由深蓝色变成红色或粉红色时,立即将切片置入自来水中终止分化。

5、封固用的中性树胶的浓度要适宜,避免产生气泡。如中性树胶过稀,容易溢出盖玻片的周围,且树胶内的二甲苯易挥发,树胶干燥浓缩后可产生气泡。如中性树胶过浓稠,滴后不容易扩散,有气泡不易排出。若封固后气泡存留,既影响切片观察,又影响切片保存。因此有气泡产生时,应轻轻按压盖玻片,将气泡驱除。

6、脱蜡用二甲苯应该经常过滤,并定期更换新液,脱蜡时应避免将二甲苯过多地带入酒精中出现云雾现象。

7、为了加速脱蜡过程,可将切片预先进行加温,再行脱蜡。

8、苏木素染色时间的长短,主要依据气温的高低,染液的新旧,组织的差别以及组织所使用固定液不同而有所区别,很难提出一个确切的时间,一般先染5-10min,取出后返蓝,镜下观察,若染色不足,可延长染色时间。

9、苏木素使用一段时间后,表面易出现亮晶状氧化漂浮物,必须勤过滤,否则粘附于组织上时不易去掉,苏木素液颜色为灰蓝色时应弃掉换新液。

10、盐酸酒精分化是苏木素染色的关键,分化时间长短很难确切说出,只有凭经验来控制操作,分化时细胞核以外成分首先脱色,其次胞核开始脱色,分化时应随时在显微镜下观察,使组织着染适度,分化鲜明,一般在盐酸酒精中将组织分化成淡粉色为宜。

11、分化适度的切片,应立即用水冲洗,否则残存在切片上的盐酸酒精仍然进行着脱色作用,冲洗时水流不宜过大,以防脱片,冲洗时间不应少于10min。

12、为了缩短冲洗时间,可用返蓝液,但必须充分水洗,否则影响伊红的着色。

13、伊红应该淡染,以免喧宾夺主,应该色彩对比适当,鲜明艳丽。

14、组织切片的脱水,透明等必须彻底,否则切片易呈云雾状,难以镜检。脱水用酒精必须定期检查更换,以保证有效浓度。

15、切片有脱落现象时,可用0.5%稀火棉胶液防止,切片脱蜡至纯酒精后,如火棉胶液浸半分钟,取出稍干,如80%酒精中硬化火棉胶,然后入水洗,进行染色。

0.5%火棉胶配方:

纯酒精   90ml

乙醚   90ml

5%火棉胶液   20ml