免疫组化染色方法及常用抗原修复方法，建议收藏✔

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（每周更新防走丢～）

免疫组化染色方法

SP法

1）脱蜡、水化；

2）PBS洗2～3次各5分钟；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；

4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；

6）PBS洗2～3次各5分钟；

7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10）PBS洗3次各5分钟；

11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；

12）II抗中可加入0.05%的tween-20。

13）PBS洗3次各5分钟；

14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；

15）PBS或自来水冲洗10分钟；

16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；

17）自来水冲洗10～15分钟；

18）脱水、透明、封片、镜检。

SABC法

1脱蜡、水化。

2PBS洗两次各5分钟。

3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。

4抗原修复。

5PBS洗5分钟。

6滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

7滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。

8PBS洗三次每次2分钟。

9滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。

10PBC洗3次每次2分钟。

11滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。

12PBS洗4次每次5分钟。

13DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

14蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15脱水、透明、封片、镜检。

常用抗原修复方法

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片：

1）抗原热修复 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 ± 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

（1）高压热修复 切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）或0.001M EDTA（pH8.0）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。

（2）煮沸热修复 切片脱蜡至水后，放入盛有0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，

（3）微波热修复。切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟（胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%至0.25%）； 胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10mg/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

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