【IF：19.32】一文集齐泛素化、磷酸化、m6A！

磷酸化研究不明确到修饰位点，不深刻

泛素化研究不明确到修饰位点，不深刻

M6A研究不明确到复合体成分，也不深刻

研究都有三板斧

1.确定结合关系（酶与底物相互作用）

2.筛选修饰位点（挨个检测）

3.修饰位点突变验证（挨个突变）

小知识：

1.磷酸化位点通常是丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr),可以将这些氨基酸利用定点诱变的方式突变为丙氨酸(Ala)或谷（天冬）氨酸(Asp),从而将原有的磷酸化位点失活。

2.泛素化位点通常是赖氨酸残基（Lys），可将其突变为精氨酸(Arg)，从而不能被泛素化。

今天给大家带来一篇 Molecular Cell （IF：19.32）期刊的文章。

本文确定 ERK 通路和USP5是 m6A沉积 的正调控因子：ERK在METTL3的S43/S50/S525位点磷酸化METTL3，在WTAP的S306/S341磷酸化位点磷酸化WTAP，然后ERK被USP5去泛素化，使m6A甲基转移酶复合体（METTL3 & METTL14 & WTAP）稳定。同样的磷酸化也可以在ERK激活的人类癌细胞中发现，并有助于肿瘤的发生。

全文亮点：

1、ERK通路的激活导致m6A加急转移酶复合体成分（METTL3和WTAP）的磷酸化。

2、METTL3磷酸化增加了USP5介导的METTL3脱泛素化以稳定METTL3。

3、METTL3磷酸化可促进骨髓间充质干细胞分化。

4、ERK激活的肿瘤细胞中METTL3的磷酸化与肿瘤的发生密切相关。

思路导图：

结果部分:

Fig.1 ERK激活促进m6A甲基化

为了确定m6A RNA甲基化的调节因子，作者在Hela细胞中使用了一个包含了GGACU基因序列的环状RNA GFP报告基因。该RNA连接GFP的两个外显子片段，如（图1A）的示意图所示。环状RNA上的GGACU基因序列的m6A甲基化可以驱动GFP转录本的翻译启动，产生GFP荧光信号。因此，来自这个环状RNA报告基因的GFP信号可以用作m6A甲基化的读数。接下来是基于CRISPR基因敲除的基因组筛选，（图1B）就是将CRISPR基因敲除文库与circRNA m6A-GFP的分析报告相结合，筛选出m6A甲基化的可能调节因子。

结果显示促进或抑制m6A甲基化的基因敲除会减少或增加GFP转录本的翻译。收集了GFP表达最高和最低的细胞后去进行高通量测序，结果显示METTL3的敲除导致了GFP信号的较弱（图1C）。在低GFP的细胞gRNAs的路径中确定了涉及RAS和MAPK信号通路的基因（图1C和图1D）。

结果表明，MAPK通路的激活促进了m6A基因的甲基化。

Fig.2 ERK使METTL3和WTAP磷酸化 

为了确定ERK是如何激活m6A甲基化，首先测试了ERK与mRNA m6A甲基转移酶复合体的相互作用。（图2A）的结果有显示在A375细胞中观察到了内源性的ERK2与METTL3和WTAP的相互作用，A375是一种由于BRAF V600E突变而具有结构性ERK活性的人黑色素瘤细胞系。

用真核线性数据库进行的分析表明，METTL3中的第415-421个残基和WTAP中的71-77个残基是潜在保守的D结构域（图2B）。从（图2C）可以看出ERK2是CD突变（321N）的形式，而不是FRS突变（263A）形式，所以得出结论：突变的ERK丧失了其与METTL3和WTAP的相互作用。

接下来作者发现p38MAPK和JNK可以磷酸化METTL3，但不是ERK5，但磷酸化程度不如ERK2。（图2D和2E）。突变位点去进一步分析证实了图2F中的三个位点是ERK主要的磷酸化位点。这表明磷酸化发生在ERK结合区的附近。

为了确定磷酸化的位点，作者检测了S/T-P基因序列的图片是否影响ERK诱导的磷酸化。在（图2G），人的WTAP的三个S/T-P基因序列中，作者发现S306和S341是人WTAP的主要ERK磷酸化位点（图2H）。综上所述，ERK与METTL3和WTAP相互作用且被磷酸化。

Fig.3 ERK介导的METTL3稳定需要USP5参与

接下来作者研究了ERK诱导的磷酸化是如何增加m6A甲基化转移酶复合体的活性。

WT-METTL3（野生型METTL3）

3A-METTL3（模拟非磷酸化METTL3）

3E-METTL3（模拟磷酸化METTL3）

（图3A）可以得出WT-METTL3的转染细胞在mESCs和A375细胞中保持了比 3A-METTL3更高的表达水平。从（图3B）也可以看出3A-METTL3的泛素化水平高于WT-METTL3。（图3C）中所示，ERK激活增加了WT-METTL3的稳定性，但不能增加非磷酸化3A-METTL3的稳定性；与WT-METTL3相比，模拟磷酸化 3E-METTL3显示出更高的稳定性。      

 通过CRISPR的基因组筛查中发现了脱泛素化酶。ERK的激活增加了METTL3和USP5之间的相互作用，这种相互作用在磷酸化缺陷的突变体S43A、S50A、S525A中变得更弱，当这三个位点都发生突变后，这种作用完全减弱了（图3D）。

 由于USP5是一种可以防止蛋白质泛素化的酶，作者进一步研究了USP5通过脱泛素化稳定了METTL3，从（图3E）中可以看出USP5减少了METTL3的泛素化。通过数据库搜索以及结合CRISPR基因组的筛选，最后确定了FBXW8、FBXW12、SPOPL、TRIM2和ANAPC1是m6A甲基化的负调控因子。为了进一步了解泛素化连接酶在METTL3中的降解作用，将针对泛素化连接酶的siRNA导入USP5基因敲除的A375细胞。SPOP、TRIM28或ANAPC1的敲除部分取消了USP5抑制介导的METTL3降解（图3F）。

综上所述，USP5通过去泛素化稳定了METTL3。

Fig.4 ERK对METTL3/WTAP的磷酸化促进干细胞多能分化

作者通过质谱检测对m6A进行定量分析，可以得出3A-METTL3和2A-WTAP协同减少（图4A）。用SRB法检测了R-WT和R-3A2A mESCs的细胞生长，R-3A2A mESCs增殖效率提升（图4B）。这些观察表明METTL3和WTAP磷酸化的缺失捕获了处于多能性状态的mESCs。

METTL3缺陷的mESCs细胞还是具有多功能性，可能是m6A的缺失阻碍了多能性，促进了转录本的降解。（图4C）的m6A-RIP-qPCR结果证实了m6A的减少。QPCR结果表明m6A标记的多功能转录本在R-3A2AmESCs中上调（图4D）。（图4E）是绝对定量QPCR分析了EB诱导后多功能性和分化标志物的表达，结果显示未能抑制多能基因的表达，还上调了分化记物。

Fig.5甲基转移酶复合体磷酸化对小鼠胚胎干细胞转录本的影响

该部分主要是研究m6A甲基化转移酶复合体的磷酸化如何影响m6A修饰的转录本。 （图5A）是一个R-WT和R-3A2AmESCs（METTL3磷酸化缺陷）中m6A修饰位点的Log2峰强度的累积分布函数。 可以看出R-WT和R-3A2AmESCs的比较显示甲基化位点的大范围内的丢失。 （图5B）是R-WT和R-3A2AmESCs之间m6A强度不同的峰的火山图，作者发现R-WT与R-3A2A相比m6A峰显著减少。 （图5C）是Nanog，Lefty1和Zfp219的m6A峰的覆盖图，比较R-WT和R-3A2AmESCs的m6A修饰位点。 （图5D）和（图5E）显示了m6A甲基化减少和差异表达的转录本丰富了与多能性和mRNA处理相关的基因本体论。 与R-WT mESCs相比，R-3A2A细胞中涉及多能性的多个基因m6A甲基化较少（图5F）。

Fig. 6 m6A甲基转移酶复合体的磷酸化可能影响肿瘤的发生

作者通过文献得知RAS/RAF/MEK/ERK信号通路作为癌症中最常见的突变信号通路之一，被认为是一个治疗癌症的靶点。在R-3A2A375人黑色素瘤细胞中，m6A甲基化转移酶稳定性降低（图6A），导致了m6A在mRNA上的整体水平较低。MEK抑制剂PD0325901和曲美替尼在8h可降低A375黑色素瘤细胞m6A甲基化转移酶的蛋白水平（图6C），处理48h可降低m6A的总mRNA水平（图6D）。Vialinin为USP5的抑制剂，添加这个抑制剂会导致METTL3的泛素化增加且METTL3的蛋白水平下降（图6E）。MEK抑制、R-3A2A或METTL3-WTAP敲除可以是375A黑色素瘤细胞对USP5抑制敏感（图6F）。最后图6G和6H结果显示，两种HER2抑制剂，图卡替尼和拉帕替尼，可以降低HER2阳性乳腺癌患者8小时的METTL3蛋白水平和48小时的细胞m6A甲基化水平。

总结： 

总体而言，上述实验数据支持了ERK依赖的METTL3稳定性会影响细胞内总mRNA的m6A水平，这可能有助于肿瘤的发生，但还需要更有针对性的癌症研究来评估这种调控机制的效果和适用范围。

好啦，本期的精品文献导读就到这里

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