Wb经验铁‖page 6一二抗抗体孵育

现在来最后的几步了，一抗二抗的孵育是个重要的节点，需要很注意的。

一：Wb一二抗的原理问题

1、原理，简而言之就是一抗特异性结合+物理性结合趴在膜上，只要有一抗趴住了，二抗结合上去，二抗上的特异性的东西（辣根过氧化物）就可以去显影了。

注意说!!!!!，这里要特别注意，要特别注意，要特别注意，一抗的结合方式不只是单纯的特异性结合，还有物理性结合，对就是物理性结合，这种结合可以说是趴在空位上（例如44.5kd），也可以是44kd上类似于“覆盖”着一层。第一种趴在上面的话，我们前面讲过了，牛奶封闭可以解决。第二种“覆盖”的话，没有那么牢靠，还是可以通过tbst洗脱的，所以为啥一抗以后要洗了！同理二抗！

2、一抗、二抗稀释比例问题。

一般而言，我们根据他们的说明书来稀释，但是有些东西，是不一样的存在，比如说乳酸脱氢酶ldha他是国产的他一般稀释1：3000，可能国外的就是1:10000 了，比如武汉三鹰。所以具体的你根据你的药品说明书来稀释，不要机械化的师姐说！

然后关于抗体选购问题，我之前也发过一个帖子，有些你买的国产的就真的不行，或许你换了产地就可以了。

（说个题外话，听说某某公司就是把外国的抗体进行稀释，然后再包装买卖，所以有时候你去看看别人发过文章的抗体是哪里买的，这个很有必要！）

（帖子，看看，看看别人文章用的哪里的抗体，你搜你要用的抗体，哪个公司，一下子就知道了）

3：关于具体的稀释

我这里本来第二点就可以讲完的，但是我又放到了第三点，说明很重要！！！！！！

关于稀释浓度问题：原则上以公司的浓度为上限，自己再合理的增加一下稀释倍数。

比如武汉三鹰的，写的是1：1000，可能我稀释的时候1：1500的比例进行稀释。

稀释用的溶液是：2%bsa溶液，这个也好配：1g牛胎蛋白：50ml的tbst。这就是2%的bsa了，不需要去买啥稀释液，浪费钱！！

但是，你涉及到了国内某些牌子，可能就是要提高了浓度了，原因之前也讲过。

为啥这么注重一二抗的浓度？稀释比例？

因为你的抗体比例高了，会导致你的膜整体高背景，条带会显得正片的水墨染色！所以注意抗体的比例！

二：常见的操作步骤及处理

1：时间问题

牛奶封闭完以后，一般是tbst先快洗，然后慢洗，快洗如同前面讲的，慢洗的话，5 5 5min就好，不要洗太长时间了。

然后一抗孵育的话，孵1.5h，17-18振幅，近胶侧向上，常温。孵育完以后，先快洗，如上，然后慢洗10 10 7 min摇床洗，振幅相同。一抗孵育可以过夜，冰箱，但是尽量不要过夜吧。用完以后一抗可以回收，做个标记，大概用7次差不多。

洗完以后，二抗孵育，40min-1h，17-18振幅，近胶侧向上，常温。孵育完以后，先快洗，如上，然后慢洗7 7 5 min摇床洗，振幅相同。二抗孵育时间不能太长，切记，不能太长，一个小时为底线（原因前面讲了）！！！！！

2：如果忘记了顺序，加错了顺序，怎么办？

一般是tbst先快洗，然后慢洗，快洗如同前面讲的，慢洗的话，10 10 7min就好，不要洗太长时间了。然后重新敷抗体

3：抗体加多少？

浸没基础上，2-3mm高度的抗体液。

4：注意别拿错了二抗

有些实验室她是有兔抗也有鼠抗，有新人会把兔抗混成了鼠抗体。

一抗二抗问题，我目前能想到的就只有这么多，预知后事如何，请听下回分解！