棕榈酸钠添加剂（Palmitic acid）处理HepG2细胞建立非酒精性脂肪性肝病NAFLD体外模型

编辑：鲲创生物/鲲创科技（Kunchuang Biotechnology）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD），又被称为肝脏甘油三酯（TG）过度沉积（>5%肝重），是指除外酒精和其他明确的肝损害因素所致的，以肝脏脂肪变性为主要特征的疾病，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化、肝硬化以及肝细胞癌。NAFLD已成为全球最常见的慢性肝病病因之一，每年造成116万人死亡。脂肪酸介导的脂毒性是NAFLD发生发展的重要机制。棕榈酸作为人体含量最丰富的饱和脂肪酸，具有显著的脂毒性，常用来建立体外NAFLD细胞模型。

一篇发表在Digestive and Liver Disease 2022上的文章（Ubiquitin-specific peptidase 10 ameliorates hepatic steatosis in nonalcoholic steatohepatitis model by restoring autophagic activity）研究了自噬与NAFLD的关系。作者建立体内外NAFLD模型验证了去泛素化特异性肽酶（Ubiquitin-specific peptidase, USP）10通过自噬途径改善NAFLD病情的积极作用。

在动物实验，作者通过甲硫氨酸-胆碱缺乏饲料喂养小鼠8周建立非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatosis hepatitis, NASH）模型。Western blotting结果可见，与健康对照相比，NASH小鼠肝脏USP10、LC3B-2、ATG4b、ATG7、ATG13和LAMP2的表达降低，提示肝脏自噬功能受损（图1）；当小鼠肝脏USP10表达上调时，伴随LC3B-2、ATG5、ATG7、ATG13、LAMP1和LAMP2表达升高，提示USP10可以增强NASH小鼠肝脏的自噬活性（图1）。透射电子显微镜的结果更直观地显示USP10可增加NASH小鼠肝脏自噬小体的数量，并捕捉到自噬小体正在吞噬脂滴的现象（图2）。此外，组织学结果表明，USP10表达上调可减轻NASH小鼠肝脏脂肪变性、炎症和纤维化（图3）。

进一步，通过细胞实验验证USP10是否通过自噬途径减轻肝脏脂肪变性。作者采用棕榈酸钠（350 μM）处理HepG2细胞24小时以建立NAFLD体外模型。Western blotting结果显示，与溶剂对照相比，棕榈酸钠可使HepG2细胞LC3B-2的表达降低（图4）；当USP10表达上调时，细胞LC3B-2表达升高（图4）。因此，USP10可以恢复棕榈酸钠干预时HepG2细胞自噬活性。油红O染色结果发现，与溶剂对照相比，棕榈酸钠可使HepG2细胞出现明显脂滴沉积（图5）；USP10表达上调时，HepG2细胞脂滴沉积显著减弱（图5）；叠加自噬抑制剂——3-甲基腺嘌呤的干预，USP10的减脂效应被削弱。上述结果提示，USP10可通过自噬途径减轻肝细胞脂肪变性（图5）。

图1. USP10对NASH小鼠肝脏自噬活性的影响。Western blotting检测小鼠肝组织LAMP2、USP10、LAMP1、ATG7、ATG13、ATG5、ATG4b、LC3B-1、LC3B-2、NA-K ATP酶等的表达。SD，标准饲料；MCDD，缺乏蛋氨酸-胆碱饲料；LC，微管相关蛋白1轻链；ATG，自噬相关基因；LAMP，溶酶体相关膜蛋白；USP：泛素特异性肽酶。

图2. USP10对NASH小鼠肝脏自噬小体数量的影响。透射电子显微镜下观察小鼠肝组织自噬小体。大图中黄色的A指示自噬小体。绿色的LD指示脂滴。带序号的小图为相应红色框区域的放大图，可更清晰观察到自噬小体。SD，标准饲料；MCDD，缺乏蛋氨酸-胆碱饲料；USP，泛素特异性肽酶。

图3. USP10对NASH小鼠肝脏组织学的作用。小鼠肝脏切片HE染色、油红O染色、天狼星红染色检测肝脏脂肪变性、炎症、气球样变和纤维化的程度，并计算NAFLD活动度评分。SD：标准饲料；MCDD：缺乏蛋氨酸-胆碱饲料；NAFLD：非酒精性脂肪性肝病；USP：泛素特异性肽酶。

图4. USP10对棕榈酸钠干预下HepG2细胞自噬活性的影响。Western blotting监测HepG2细胞USP10、LC3B-1、LC3B-2等的表达。Veh，溶剂对照；PA，棕榈酸钠； LC，微管相关蛋白1轻链； USP，泛素特异性肽酶。

图5. USP10及3-MA对棕榈酸钠干预下HepG2细胞脂滴沉积的影响。USP10过表达的HepG2细胞经3-甲基腺嘌呤（5 mM）干预6小时后，再用棕榈酸钠（312.5 mM）干预24小时。油红O染色用于染脂滴。DAPI和苏木素用来染核。各组细胞油红O染色图像及510 nm处光密度值如图所示。Veh，溶剂对照；PA，棕榈酸钠；3-MA，三甲基腺嘌呤；USP，泛素特异性肽酶。

总结与分享：

棕榈酸钠可以用来诱导体外NAFLD模型。本研究采用350μM棕榈酸钠处理HepG2细胞24小时，一方面细胞出现显著脂滴沉积，另一方面细胞自噬活性减弱。因此，该造模方法适用于研究NAFLD及其与自噬的课题。

参考文献

Ubiquitin-specific peptidase 10 ameliorates hepatic steatosis in nonalcoholic steatohepatitis model by restoring autophagic activity：Palmitic acid(PA) and vehicle were purchased from Kunchuang Co.Ltd.