强势来袭！国自然热点-外泌体研究的解决方案

各位老师好，大家好。今天我们来分享下外泌体的一些研究解决方案。

外泌体最近几年受到广泛关注，早已经成为生物医学研究的新宠儿。但是在1981年，外泌体的概念第一次被提出，但并未受到足够重视。直到2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯-罗思曼，兰迪-谢克曼及德国科学家托马斯-祖德霍夫，以表彰其在细胞间囊泡运输调控机制领域作出的杰出贡献，将外泌体研究的热度再一次推向了高潮。2020年外泌体资助项目达到两千余项。

什么是外泌体外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。广泛存在于细胞培养上清及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。获得外泌体后，对外泌体进行标记，观察外泌体被摄取情况，再进一步探索外泌体的功能，如组织修复、肿瘤转移、代谢重建等等。

1.外泌体分离提取

外泌体分布在生物体液以及细胞培养上清中，分离提取的方法有很多，例如，超速离心法，磁珠免疫法，PEG沉淀法，排阻色谱法SEC等，每种方法都有各自的优缺点。比较常见的就是超速离心法，还有使用商业化的外泌体提取试剂盒等等。

差速超速离心法（左）分离富集外泌体以及等密度梯度离心法（右）纯化外泌体流程

商业化的外泌体提取试剂盒流程

2.外泌体鉴定

（1）电镜：分析外泌体的大小/形态，一般多用透射电镜；

样本一般就是外泌体溶液，通过超速离心获得的样本，取25%的戊二醛11uL，加入100uL外泌体中混匀，4度固定过夜。 将样本滴在碳支持膜铜网放置3-5min，然后用滤纸吸去多余液体。透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

（2）WB：检测外泌体标志蛋白的表达；

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot,是将电泳分离后的细胞或组织中蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。应用非常广泛。

（3）纳米颗粒示踪分析NTA：检测外泌体粒径及浓度；

（4）动态光散射DLS：外泌体颗粒的大小分布及其zeta电位；

（5）流式细胞分析：检测外泌体粒径大小和生物标志物表达；

（6）酶联免疫法ELISA ：外泌体浓度定量及外泌体特异性蛋白的定量；

3.外泌体转录组学和蛋白组学分析

外泌体中携带有来自母本细胞的多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息。外泌体RNA，包括非编码RNA（microRNA、lncRNA、circRNA）与编码RNA（mRNA），它们在细胞间起着信息传递、调控基因表达的重要作用。

转录组学分析：对外泌体中的RNA 进行转录组测序及分析；

作用：能够筛选外泌体携带的特异 Biomarker，对深入了解疾病或不同发育阶段的内在机制有重要意义。

蛋白组学分析：是指利用质谱技术对外泌体蛋白进行分析(外泌体膜上的蛋白质/外泌体中包含的蛋白质)，外泌体蛋白质组学成为发现癌症标志物的一个新研究方向。

作用：研究外泌体及蛋白质在生命活动如疾病发生和进展中的作用；发现与疾病相关的蛋白质，作为疾病早期诊断和预后评估的生物标志物。

4.外泌体功能验证（外泌体示踪）

目前已发表的外泌体文章中，外泌体大多使用亲脂性染料进行标记，体内和体外都有较多应用。

（1）体外验证功能：筛选外泌体关键分子及作用机制通路。包括受体细胞对外泌体的摄取，摄取后受体细胞的基因表达验证及功能检测，如细胞增殖、凋亡、迁移等。亲脂性染料主要分为两大类，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，所以染色效果较好，应用较广泛。

（体外细胞实验示踪）

PKH67标记的外泌体与心肌细胞共培养

外泌体内吞实验。图中绿色的部分是鬼笔环肽染色，鬼笔环肽是应用于细胞骨架的染色。因为，可以明显的看到外泌体处于细胞的内部，被心肌细胞吞噬。

PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.

（2）体内实验：证明疾病动物模型外泌体功能。包括动物模型构建、外泌体注射动物模型、活体成像、动物表型检测等。

体内验证小动物活体成像方法：

①磁共振成像MRI（Magnetic Resonance Imaging）：例如，外泌体装载超顺磁性氧化铁纳米颗粒（MRI造影剂），用于磁共振跟踪。

②计算机断层扫描技术CT（computed tomography）：例如，金纳米颗粒GNPs标记外泌体，在小鼠疾病模型对其进行无创跟踪。

将金纳米颗粒标记的外泌体通过鼻内给药不仅能进行无创跟踪，而且能促进外泌体在脑部的积累和延长在病变区域的存在时间，增强体内神经成像的效果。因此，这种外泌体标记技术可以作为多种脑疾病的强大诊断工具，并可能增强基于外泌体的神经恢复治疗。

金纳米颗粒外泌体的制备及体内注射ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.

用金纳米颗粒和PKH26对外泌体进行双标记ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.

③正电子发射型计算机断层显像PET（Positron Emission Computed Tomography）：例如，放射性标记的聚乙二醇化外泌体，注射到小鼠模型体内，PET成像观察肿瘤对外泌体摄取情况。

④生物发光成像：外泌体用荧光素酶标记，注射动物模型，检测外泌体在动物模型体内各器官分布情况（需要在每次成像之前注入底物）；

还有另一种方式，通过慢病毒介导CD63-GFP表达

将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。

用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.

⑤荧光成像：荧光标记外泌体，如Cy5，DiR等，注射动物模型，检测外泌体在动物模型体内各器官分布情况；

1.Di系列的亲脂性染料，包括DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光）。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。

DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.

2.用Gaussia luciferase（gluc）和截断的lactadherin标记：

将gLuc-lactadherin构成融合表达的质粒，再将此质粒转染细胞，使细胞分泌的外泌体带有强的萤光素酶活性。将标记的外泌体进行静脉注射入小鼠体内，看外泌体在组织的分布情况。

将表达了gluc- lactadherin的外泌体静脉注射入Balb/c小鼠J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.

外泌体标记对探究外泌体的功能是必不可少的一个步骤，首先需要观察到外泌体被受体细胞吸收或到达目的组织、器官，再检测受体细胞、组织或器官中相应指标的变化，看外泌体是否具有一定的功能。确定外泌体具有功能后，再通过高通量测序进行差异表达分子的挖掘，进一步深入研究机制。

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