干细胞成脂成骨定向诱导分化-骨相关疾病、干细胞及肿瘤干细胞干性热点研究

技术原理

干细胞和祖细胞群体存在于多种成体组织中，包括皮肤、肌肉、骨髓和脂肪。在体外不同条件下诱导分化为骨、软骨及其他结缔组织，因其来源广泛，分离无创伤，较低的免疫原性、生长周期短等特点，是组织工程种子细胞的重要来源。干细胞的诱导分化一方面是干细胞鉴定的主要方法，另一方面也是干细胞功能学研究的主要途径。采用体外条件培养基诱导培养下，人间充质干细胞应能够分化为成脂肪、骨、软骨细胞。成脂分化经油红O染色法鉴定，成骨分化经茜素红染色法鉴定，成软骨分化经阿尔辛蓝染色法鉴定。近年来，人们发现成体脂肪组织可作为间充质干细胞另外一一个丰富的来源。这群细胞被命名为脂肪来源的干细胞(ASCs)。在特定的培养条件下，ASCs可诱导分化为多种间充质和神经类型细。

应用范围

1. 干细胞分化能力鉴定；

2. 肿瘤干细胞干性相关研究;

3 . 某类干细胞成脂定向分化机制研究;

4 . 某类干细胞成骨定向分化机制研究;

5 . 干细胞以及肿瘤干细胞外泌体治疗疗效机制研究;

6 . 骨发育相关疾病机制研究；

7 . 骨代谢相关疾病机制研究;

8 . 骨衰老相关机制研究；

9 . 骨损伤相关疾病机制研究;

10 . 骨质疏松相关疾病机制研究；

11 . 骨肿瘤相关疾病机制研究；

12 . 肥胖相关疾病机制研究；

13 . 其他脂肪相关疾病机制研究；

成骨诱导分化

一、成骨诱导分化完全培养基的配制

1. 使用前，请将血清置于2-8℃环境中过夜解冻直至血清完全溶解，轻晃试剂瓶以确保血清混合均匀。

注意： 解冻后的血清中可能会含有少量絮状沉淀，这些物质对产品质量无影响。不建议

采取过滤的方法去除沉淀物，此操作会导致血清中部分营养物质流失。

2. 配制前30 min左右，室温溶解抗坏血酸，β-甘油磷酸钠，双抗和谷氨酰胺，轻轻地上下颠倒试剂管以确保试剂混合均匀。

注意： 在打开盖子前先短暂离心（2400 g），以确保添加试剂能全部收集。

3. 使用前10 min，室温溶解地塞米松。

注意： 在打开盖子前先短暂离心（2400 g），以确保添加试剂能全部收集。

4. 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁，室温放置数秒使酒精挥发。

5. 在超净台中无菌地打开以上各瓶/管。

6. 将抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、成人脂肪间质干细胞专用胎牛血清、双抗和谷氨酰胺全部加入成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化基础培养基中。

7. 无菌吸取少量基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入基础培养基中。

8. 最后将地塞米松加入基础培养基中，吸取0.5 mL基础培养基洗涤试剂管，将混合物一同加入基础培养基中。

9. 重复操作步骤 8。

10. 轻晃配制好的完全培养基，确保混合均匀之后即可使用。 

二、培养器皿表面的明胶包被

      为了避免诱导过程中间质干细胞出现漂浮现象，建议对成骨诱导使用的培养器皿

表面进行明胶包被。

所需材料

1. 明胶溶液

操作

1. 加适量0.1%明胶到培养器皿中，能覆盖整个培养器皿底面的量即可。

2. 摇匀液体使其覆盖整个培养器皿的底面。

3. 将铺有0.1%明胶的培养器皿放置在超净台至少30min。

4. 30 min后弃去明胶， 待培养器皿晾干后，即可用于接种细胞。

注意: 包被明胶的培养器皿在无菌和明胶不蒸干的条件下，可以在4℃保存两周。

三、成骨诱导分化操作规程

 所需材料

1.  0.25%Trypsin-0.04%EDTA 

2.  生理盐水

3.  成人脂肪间质干细胞完全培养基

4.  成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基

操作

注意： 本操作规程以六孔板为例

1. 将成人脂肪间质干细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。

2. 当细胞融合度达到80-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化。

3. 将先包被0.1%明胶的六孔板中的多余明胶吸去，并用生理盐水清洗1-2次。

4. 将消化下来的 成人脂肪间质干细胞按照2×104cells/cm2 的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。。

5. 将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。

6. 当细胞融合度达到80%-90%时，小心的将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL/well 成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基。

7. 每隔3天换用新鲜的成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化完全培养基（使用

前需预热至37℃）

8. 诱导2-4周后，肉眼观察可发现大量白色物质析出，镜下观察可发现细胞抱团成红褐色梭状，即可用茜素红进行染色。

 注意：为防止成骨细胞脱落，建议成骨过程中出现大量钙结节之后，换液形式变为每两天一次半量换液。

四、茜素红染色分析

所需材料

1.  生理盐水 

2.  4%中性甲quan溶液

3.  茜素红染液

操作

1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用生理盐水冲洗1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲quan溶液，固定30 min。

2. 吸走中性甲quan溶液，用生理盐水冲洗1-2次。每孔中加入1mL茜素红染液染5-10min。（茜素红平常呈黄色，与钙快速反应，溶液颜色快速变为红色，即可初步判定为实验诱导成功）

3. 吸走茜素红染液，用生理盐水冲洗2-3次。

4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

下图为成人脂肪间质干细胞成骨诱导分化茜素红染色效果

ADSCs成骨对照

4X

10X

20X

40X

五、产品稳定性及保存条件

1. 所有产品均需避光保存。

2. 间质干细胞成骨诱导分化基础培养基和茜素红置于2-8℃保存，保质期为1年；其他成分置于-20℃保存，保质期为2年；完全培养基配制好后于2-8℃保存，保质期为1个月。

3. 所有产品请于保质期内使用，超过保质期，必须放弃使用。

4. 为确保产品质量，请避免反复冻融相关产品。

成脂诱导分化

一、成脂诱导分化培养基 A 液的配制

1. 使用前，请将血清置于2-8℃环境中过夜解冻直至血清完全溶解，轻晃试剂瓶以确保血清混合均匀。

注意： 解冻后的血清中可能会含有少量絮状沉淀，这些物质对产品质量无影响。不建议

采取过滤的方法去除沉淀物，此操作会导致血清中部分营养物质流失。

2. 配制前30 min左右，室温溶解地塞米松、胰岛素、IBMX、罗格列酮、双抗和谷氨酰胺，轻轻地上下颠倒试剂管以确保试剂混合均匀。

注意： 在打开盖子前先短暂离心（2400 g），以确保添加试剂能全部收集。

注意： 为了确保溶解效果良好，请将 IBMX 放置于 37℃水浴锅中温热直至完全溶解。

3. 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁，室温放置数秒使酒精挥发。

4. 超净工作台中将成人脂肪间质干细胞专用胎牛血清、双抗和谷氨酰胺全部加入成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基 A 液基础培养基中。

5. 无菌吸取少量A液基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入A液基础培养基中。

6. 将地塞米松、胰岛素、IBMX和罗格列酮全部加入A 液基础培养基中。

7. 无菌吸取少量A液基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入A液基础培养基中。

8. 重复操作步骤7。

9. 轻晃配制好的完全培养基，确保混合均匀之后即可使用。

二、成脂诱导分化培养基 B液的配制

1. 使用前，请将血清置于2-8℃环境中过夜解冻直至血清完全溶解，轻晃试剂瓶以确保血清混合均匀。本公司血清经热灭活处理，解冻后即可使用。

2. 配制前30 min左右，室温溶解胰岛素、双抗和谷氨酰胺，轻轻地上下颠倒试剂管，以确保试剂混合均匀。

注意： 在打开盖子前先短暂离心（5000 g），以确保添加试剂能全部收集。

3. 用70%乙醇擦拭试剂盒中各瓶/管的开口外壁，室温放置数秒使酒精挥发。

4. 超净工作台中将成人脂肪间质干细胞专用胎牛血清、双抗和谷氨酰胺全部加入间质干细胞成脂诱导分化培养基 B 液基础培养基中。

5. 无菌吸取少量 B 液基础培养基洗涤各瓶/管，尽可能的将所有组分完整的加入B液基础培养基中。

6. 将胰岛素加入B 液基础培养基中。

7. 无菌吸取少量 B 液基础培养基洗涤试剂管，尽可能的将所有组分完整的加入 B 液基础培养基中。

8. 重复操作步骤7。

9. 轻晃配制好的完全培养基，确保混合均匀之后即可使用。

三、成脂诱导分化操作规程

所需材料

1. 0.25%Trypsin-0.04%EDTA 

2. 生理盐水 

3. 成人脂肪间质干细胞完全培养基

4. 成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化完全培养基

操作

注意： 本操作规程以六孔板为例

1. 将成人脂肪间质干细胞37℃，5% CO2的培养箱中培养。

2. 当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%Trypsin-0.04%EDTA进行消化。

3. 将消化下来的间质干细胞按照2×104 cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2 mL完全培养基。

4. 将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。

5. 每隔三天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。

6. 小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL成人脂肪间质

干细胞成脂诱导分化培养基 A 液。

7. 诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基B液。

8. 24h后，吸走B液，换回A液进行诱导。

9. A液和B液交替作用3-5次后（12-20天），继续用 B 液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆。B 液维持培养期间，每隔2-3天需要换用新鲜的B液。

10.肉眼观察可发现大量白色物质析出，镜下观察可发现细胞抱团成红褐色梭状，即可用油红O进行染色。

四、油红 O 染色分析

所需材料

1. 生理盐水 

2. 蒸馏水

3. 4%中性甲quan溶液

3. 油红O染液

操作

1. 成脂诱导分化结束后，吸走六孔板中的间质干细胞成脂诱导分化培养基，用

生理盐水冲洗1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲quan溶液，固定30 min。

2. 吸走中性甲quan溶液，用生理盐水冲洗1-2次。每孔中加入1 mL油红O染料工作液染色30min（工作液配制方法：油红O贮存液:蒸馏水=3:2，混匀后用中性滤纸过滤即可，现用现配）。

3. 吸走油红O染液，用生理盐水冲洗2-3次。

4. 将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果。

下图为成人脂肪间质干细胞成脂诱导分化油红O染色效果

ADSCs成脂对照

4X

10X

20X

40X

五、产品稳定性及保存条件

1. 所有产品均需避光保存。

2. 间质干细胞成脂诱导分化 A 液和 B 液的基础培养基和油红O置于2-8℃保存，保质期为1年；其他成分置于-20℃保存，保质期为2年；完全培养基配制好后于2- 8℃中保存，保质期为1个月。

3. 所有产品请于保质期内使用，超过保质期，必须放弃使用。

4. 为确保产品质量，请避免反复冻融相关产品。