版主帖| 荧光素酶报告载体构建及实验流程篇

利用荧光素酶基因表达后的易检测性和可检测性，替代直接对目的基因的检测方法，即通过荧光素酶系统报告、反馈目的基因表达水平检测，所以荧光素酶检测也称作报告系统检测。报告系统检测广泛用于研究真核基因表达和细胞生物学，受体活性、转录因子、细胞内信号、mRNA进程和蛋白表达倍数的研究。

常说的荧光素酶检测系统有双荧光素酶检测和单荧光素酶检测，双荧光素酶报告系统与单荧光素酶的区别是，双荧光素酶增加了另一种荧光质粒做对照，降低由于细胞状态和感染效率导致的差异，并且还能降低裂解及实验导致的误差，提升实验的精确度。

这个原理你需要知道：荧光素酶是作为目的基因的替代而被检测的，拥有相同元件的荧光素酶报告载体转染到细胞中，拥有与目的基因几乎相同的转录调控环境，因此检测荧光素酶的表达即可反馈目的基因的表达。上面也讲到荧光素酶检测应用广泛，本贴主要讲荧光素酶用于转录调控方面的检测，以转录因子NRF2调控下游靶基因NQO1为例子进行详细讲解，其它方面的应用大同小异。

• 报告载体构建：

要使荧光素酶能代表目的基因，那必须让荧光素酶拥有与目的基因一样的转录调控区域（想检测5’端就5’端一致，想检测3’端就3’端一致，本文主要讲顺式作用元件），找到转录因子调控靶基因的顺式作用元件，将其构建到含荧光素酶基因的载体上即可。这里根据原载体系统又可以分两种构建方法：

1. 带弱启动子的载体系统：带弱启动子的原载体系统，只需将顺式作元件部分（30bp-50bp）构建到弱启动子前方即可。
2. 
3. 不带启动子的载体系统：将整个启动子区域到顺式作用元件位置的区间（1000-3000bp随着顺式作用元件位置波动，太大建议用带启动子载体系统）全部构建到荧光素酶基因前面。
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一个是载体启动系统，一个是原基因启动系统，两者无明显优劣之分，按照使用条件选择即可。顺式元件查找参考我在园子里发的旧帖顺式作用元件查找，报告载体构建，EMSA探针设计 - 核酸基因技术 - 专业医生社区，医学、药学、生命科学、科研学术交流 (dxy.cn)，引物设计后面补一篇。选择报告载体体系，应该选择它同系列的载体。我经常用的是promega公司pGL系列和pNL系列。

• 转染和处理：

通常进行双荧光素酶检测都是用24孔板，将细胞均匀铺到24孔板中，过夜后，转染，通常要将阴性对照和阳性对照一起转染。转染的质粒量：顺式元件载体0.1-0.2ug，另一荧光素酶载体0.05-0.1ug。实验组需要过表达目的基因的在转染双荧光素酶基因的同时转染，加药在转染后的12小时进行。注意转染试剂的添加与孔内的载体总量有关，不要等量。

• 检测步骤：

1. 去掉培养基后用PBS轻轻洗一遍；
2. 加入200ul的裂解液，常温摇动裂解10min，用枪将细胞吹下来并混匀；
3. 拿出不吸光、不透光的96孔板（白板最为适合），将萤火虫荧光素酶的底物加入到96孔板中，每孔100ul；
4. 然后加入20ul裂解混合物，上机，先检测萤火虫荧光强度；
5. 加入萤火虫荧光猝灭剂以及海肾荧光素酶底物混合物100ul；
6. 上机，检测海肾荧光强度；

• 计算方法：