【求助】loxp/cre小鼠基因敲除的验证

在做A基因flox/flox的Lyz2 cre（用的是这个 https://www.jax.org/strain/004781 ）条件性敲除小鼠Lyz2主要是表达在髓系细胞macrophage，是我想要研究的

但是我的A基因在macrophage中的表达非常非常低，低到做real-time pcr的时候，内参Rpl19是16-17个循环的时候，A基因大概是28-30个循环

现在我想要验证A基因在macrophage里的敲除效率

1，首先做了鼠尾的PCR鉴定，A基因f/f和Lyz2 cre的基因都验证过了，A基因验证的是widetype 和 flox/flox mutation的两条带

2，然后我想在mRNA的水平上验证，分别验证了骨髓分化的macrophage（BMDM）和腹腔macrophage，做了好几批了，却是WT比cKO的表达更高，大概是3-4倍，溶解曲线没有问题，引物也是验证过的。因为我们实验室别人既有用到A基因flox/flox和别的cre交配得到的小鼠，也有同一种Lyz2 cre和B基因flox/flox交配的小鼠，他们都验证过敲除效率是很好的，大约60-80%。我用到的实验方法和引物跟他们是一样的。

想问问大家可能是什么原因，还需要做什么验证

3，既然mRNA水平验证不了，我还想做蛋白水平，用WB验证。同样提取的是骨髓分化的macrophage（BMDM）和腹腔macrophage，但是可能因为这个A基因的表达水平太低，我的上样量到了50ug也没有跑出来条带。提取的一只小鼠的蛋白量我只能做到这个上样量了。如果大家有方法可以指点我如何提高蛋白浓度也很感激。但是我这个A基因表达会不会太低了，要多少上样量才能跑出来呢？因为这个A蛋白本身在表达高的组织里也是很不好跑的。

荧光染色的话我不太考虑，是因为只能半定量。

4，另外我也考虑过另一种髓系细胞neutrophil上验证，但是A基因同样在这种细胞中表达很低很低，与macrophage差不多

这半年的时间我大概都花在怎么验证这个敲除效率上，还是没有做出mRNA或者蛋白水平的结果。真的很谢谢大家给我提些建议了！！