实验私藏版！WB/ELISA/PCR一个比一个惊艳，全部可套用！

实验中最常用的技术大概就是PCR、western blot、ELISA等。为了帮助初学者快速上手，减少摸索的苦恼，小编为大家精心准备了PCR、western blot、ELISA实验视频以及实验操作要点等，有了这篇干货，相信大家就能轻松搞定实验当中的疑难杂症！

一、Western blot

时至今日，虽然Western blot（WB）仍是稳坐在蛋白质研究技术的“头把交椅”上。

但近年来因WB不断被卷入学术造假的丑闻和风波中....

01  Western blot 撤稿主要原因有哪些？

①重复使用数据

Metformin inhibits cell proliferation, migration and invasion by attenuating CSC function mediated by deregulating miRNAs in pancreatic cancer cells.Cancer Prevention Research (2012）

② 修改图片数据

Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells.Molecular Cancer Therapeutics (2006)

③无法提供原始实验数据

当编辑要求作者提供原始数据（非jpg或tif格式）验证假设时，作者会以原始数据丢失，或无法再次提供可重复性数据等理由要求撤稿。

④Western blot 实验图片不够完整

以《Nature》期刊要求为例，期刊允许发表的文章对Western Blot实验图片进行剪切，但是投稿时需要提供完整的Western Blot实验图片，且要在文章中注明图片经过剪切处理，同时对实验图片长宽比也有要求。若编辑认为剪切后的图片存在故意遮挡等问题，投稿人也会面临拒稿的风险。

1.剪切的图片需要在文章中注明，且长宽比相同

2.需要提供完整的实验图片

⑤Western blot 实验图片对比度过高

有时候为了让背景更干净，条带更清晰，会对实验图片进行高对比度调节，虽然实验数据看上去更好看了，但是这样的图片数据丢失了大量原有的图像信息，极大可能不被期刊所接收。

接收                  不接收

Journal of Biological Chemistry, Good practices for preparing publication-quality figures

如何避免以上问题，让文章顺利发表呢？

02 Western blot实验流程及常见问题

①高背景问题原因及解决办法

原因 解决办法

抗体浓度太高 优化/降低一抗和二抗的浓度

抗体孵育温度过高 4 ℃ 孵育

二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应 设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度

一抗或二抗与封闭剂有交叉反应 在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 减少交叉反应.

封闭不充分 延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）

抗体与其它蛋白质交叉反应 更换不同的封闭液；勿在含生物素体系中使用脱脂奶封闭； 降低二抗浓度；检测二抗与膜的交叉反应性

洗膜不充分 增加洗涤次数

膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜现象

②信号弱或无信号问题原因及解决办法

原因 解决办法

抗体 增加抗体浓度；更换有效抗体（抗体失效）

抗原不足 增加上样量

抗原被封闭液遮蔽 试用不同的封闭液 ；优化封闭液中蛋白质浓度 ；缩短封闭时间

蛋白质样品在储存过程中降解 重新制备样品

转膜不充分,或洗膜过度 使用丽春红检测转膜效果，PVDF 膜需浸透,需正确的 转膜操作,勿过度洗膜

过度封闭 使用含 0.5% 脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液,或更换封闭剂,减少封闭时间

一抗失效 使用有效期内抗体,分装保存,避免反复冻融取用, 工作液现配现用

酶和底物失效 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物,使用新鲜的底物.

③非特异性条带问题原因及解决办法

原因 解决办法

一抗浓度过高 在满足一定的敏感性的情况下，降低一抗浓度

二抗引起的非特异条带 免疫球蛋白是一个超家族，而标本中含有大量的类似球蛋白的抗原，容易和二抗引起反应，尤其是在变性的情况下，在满足敏感性要求的前提下，更换为其它种属来源的二抗，如驴二抗，羊驼二抗等

蛋白的降解 同前

上样量过高 适当减少上样量

洗涤不完全 可适当延长洗涤时间

封闭不好 延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液

④弥散型条带问题原因及解决办法

原因 解决办法

抗体浓度太高 降低抗体浓度

蛋白质上样量太多 降低蛋白质上样量

迁移过快、电泳温度过高 降低电泳速度，低温电泳（冷室）

03 Western blot实验最全攻略

【1】WB实验细节最佳处理教程

1、WB的基本套路

2、如何在mac下分析条带

3、获得清晰的图像和图像量化

4、抗体的那些事儿

5、Western blot需要注意的细节和常见问题

6、WB如何提高效率

7、WB原理、蛋白转印和缓冲液

8、WB前传:和蛋白谈恋爱

9、WB图像排版和投稿要求

【2】Western blot实验原理及操作视频

1、WB实验技巧总结

2、蛋白质免疫印迹实验疑难解答

3、结果分析

4、实验操作

5、实验介绍

6、实验前准备

7、疑问与解答

【3】Western blot实验经典文献汇总

1、MMB vol.1312 western bloting

2、WB, Potocol-Bioworld.pdf

3、Western Blot MitoScience

4、western blot流程

5、Western Blotting

6、Western Blot配套试剂

7、Western Blot超详细步骤

【4】Western Blot实验指导流程

1、常用抗体清单

2、常用试剂配制方法

3、蛋白质浓度测定方法

4、WB试剂各组分作用

5、蛋白提取-用于ELISA检测

6、几种膜的特点比较

7、内参

8、生物大分子提取常识问题

9、细胞样品收集注意事项

10、组织样本收集注意事项

【5】实操进阶：Western blot优化和疑难解答

1、磷酸化蛋白的 western blot 实验流程

2、组蛋白western blot 实验流程

3、转为荧光 western blot

4、荧光 western blot 实验流程

6、疑难解答视频指南

二、ELISA实验

ELISA的检测目的是为了实验提供准确的实验依据，为了保证实验数据的可靠性，在实验过程中必须坚持全面的质量控制和全过程质量控制。

01 ELISA实验类型

①直接法ELISA：

所谓直接和间接是针对酶标抗体是“直接”还是“间接”引入的而言的。直接ELISA就是指抗原包被于固相载体，封闭后加入酶标记抗体，洗去未结合的酶标抗体，加入底物显色，显色深浅与包被抗原量和酶标抗体量成正比。所谓的“直接”是指在固相载体上加入酶标抗体之后，直接加底物显色，直接是指引入酶的过程是否“直接”。此为最简单的ELISA，常用于抗原活性检测或标记抗体的效价和质量的检测。

②间接法ELISA

间接ELISA与直接ELISA的区别是抗原包被于固相载体后，不是直接加酶标抗体，而是先加抗体，洗涤后再加入酶标的抗体（酶标二抗），然后洗涤加入底物显色。引入了酶标二抗后检测信号将放大数十倍。

③夹心法ELISA

夹心ELISA是把待检物放中间，应用最多的是双抗体夹心法。固相载体包被一个抗体(Capture Antibody,捕捉抗体)，封闭后洗涤，加入抗原进行反应，洗涤后再加入另外一个抗体(Detection Antibody,检测抗体)，检测抗体上需要标记有酶。双抗体夹心法中的抗原至少应该包含2个或2个以上表位。

④竞争法ELISA

将针对小分子抗原的抗体包被在酶标板上，检测时加入待测样本，使样本中的待测抗原与酶标板上的抗体结合。然后加入HRP酶标记的抗原，此抗原也可与酶标板上的抗体结合，由于酶标板上固著的抗体数量有限，因此当样本中抗原的量越多，则HRP酶标记抗原可结合的包被抗体就越少，两种抗原竞争结合包被抗体，所以称为竞争法。

02  ELISA实验流程及常见问题

①背景色过高主要有哪些原因？

原因 解决办法

不正确的洗涤：洗涤不充分或省略洗涤步骤中的任何一步均会导致背景色过高

检查洗涤缓冲液的体积并确保完成所有的洗涤步骤；确保洗涤缓冲液的正确稀释和正确使用。

底物污染：在实验时留存一些额外的底物，底物本身不应该有颜色

确保在使用前，底物不被金属离子或氧化剂污染

底物曝光：底物曝光会使底物变成蓝色

在加入板内之前要保存在暗处(即试剂瓶内)

ABC 的错误稀释

ABC 浓度过高会造成高背景色，因此要严格按照产品说明书稀释

孵育时间和温度不对

必须严格按照产品说明书来确定孵育时间和温度

②梯度稀释时出现跳孔现象主要有哪些原因？

原因 解决办法

酶标板叠放 避免酶标板叠放

梯度稀释时不准确 确定移液枪精准，梯度稀释正确

蒸发 封闭时加封板膜或盖板

酶标板底部有杂物或水珠 加试剂时确保酶标板底部干净

03  ELISA实验操作最全攻略

【1】ELISA实验操作视频

1、ELISA-1概述

2、实验介绍.wmv

3、实验前准备.wmw

4、实验操作.wmv

5、流程与技巧

6、结果分析.wmv

【2】ELISA经典文献汇总

1、A highly sensitive ELISA for quantification of adipocytokines secreted1.

2、An ELISA for quantification of human collectin 11

3、Determination of TNF-alpha levels in dengue virus infected patients

4、Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

5、Human TNF alpha ELISA Kitp

【3】ELISA实验指导手册

1、实验前必须进行的准备

2、样品稀释

3、免疫反应

4、吸光值测定

5、结果分析

6、疑问解答

【4】ELISA实验protocl

1、用于检测未知抗原的双抗体夹心法

2、用于检测未知抗体的间接法

3、试剂器材准备

4、ELISA实验最全注意事项

【5】实操讲解：ELISA 实验流程及问题解析

1、什么是酶联免疫吸附试验？

2、实验操作视频详解

3、影响结果因素分析

4、常见问题及处理方法

三、PCR实验

PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术 ，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

01 PCR实验数据无法重复被撤稿

2016年6月30日，青岛大学张克君团队在Medical Science Monitor 在线发表题为“Targeting Transforming Growth Factor-Beta1 (TGF-β1) Inhibits Tumorigenesis of Anaplastic Thyroid Carcinoma Cells Through ERK1/2-NFκkB-PUMA Signaling”的研究论文，该研究发现靶向 TGF-β1 通路的治疗可能更有效地预防原发性肿瘤的形成。这种疗法减少肿瘤发生的能力可能与 ERK1/2/NF-κB/PUMA 信号传导有关。

但是，在2022年3月4日，该文中应作者的要求被撤回，主要原因是结果无法重复。TGF-ß1 的体外实验和 RT-PCR 的结果无法重复。 

02  PCR实验流程及常见问题

PCR实验流程示意

PCR实验常见问题及解决方案

03  PCR实验技术最全攻略

【1】PCR实验原理及实操指导

1、PCR原理及应用

2、PCR引物设计

3、PCR实验操作

4、RT-PCR原理及应用

5、RT-PCR引物设计

6、RT-PCR实验操作

7、RT-qPCR原理及目的

8、RT-qPCR引物设计及验证

9、RT-qPCR实验设计及问题

10、Touch down PCR概念和原理

11、Touch down PCR引物设计和编程

12、Touch down PCR常见问题分析

13、巢式PCR 概述

14、巢式PCR 实验操作

15、巢式PCR 常见问题

16、PCR中常用工具酶

【2】PCR技术实验protocl合集

1、PCR产物的TA克隆28DNA的胶回收和连接29

2、ddRT-PCR28差示反转录PCR29

3、PCR-SSCP实验操作详细步骤

4、聚合酶链式反应28PCR29基本操作步骤

5、目的基因PCR扩增产物的克隆

6、AFLPI原理和操作

7、逆转录-聚合酶链反应28RT-PCR29

8、菌落PCR

9、实时荧光定量PCR具体实验步骤

10、限制性片段长度多态性实验(RFLP) 

11、降落PCR

12、重叠延伸PCR实验

【3】PCR 实验结果分析

1、手把手教你设计引物(图文并茂)

2、教你看懂PCR结果图(强烈推荐)

3、PCR-SSP 结果分析

4、长段PCR技术心得分享

5、RT-PCR没有产物怎么办?

6、师姐呕心沥血整理的qRT-PCR注意事项

【4】进阶版：PCR实验最全攻略

1、RT-PCR、QPCR、 Realtime-PCR, 你真的区分的开吗?

2、RT-PCR原理与实验技术

3、RT-PCR技术概述

4、PCR/RT-PCR疑难问题解答

5、QPCR基础知识

6、QPCR常见问题及期析

7、QPCR失败，罪魁祸首原来是

8、Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手

9、RT-PCR实验方法总结大全

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