【IF：19.16】机制深入到底该怎么深入？

Title：De-dimerization of PTB is catalyzed by PDI and is involved in the regulation of p53 translation (IF：16.971)

译：PDI 催化 PTB 去二聚化并参与 p53 翻译的调节

文献链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8450096/

一句话总结本文：

描述了一种 PDI 依赖的PTB 二聚体和单体之间的转化机制，而细胞质中的 PTB 单体是连接 TP53 mRNA 和翻译的桥梁。

HighLights：

1.证明了定位于细胞核和细胞质的 PTB 会分别以二聚体和单体形式存在。

2.通过截断和点突变，证实了第23位的半胱氨酸 (C) 对 PTB 的二聚化至关重要。

3.确定了PDI 是催化 PTB 去二聚化的酶，且该过程依赖于 PDI 的 a' 结构域的 CGHC 活性位点。

4.DNA 损伤后，PTB 在细胞质中积累，并伴有 PDI 的去二聚化。

5.证明了与核糖体相关的细胞质 PTB 可增强TP53的翻译。

名词解释：

(1)PTB：多嘧啶束结合蛋白 (PTB) 是一种 RNA 结合蛋白，它优先与富含嘧啶（C/G）的序列结合以调节前体 mRNA 剪接、mRNA 多腺苷酸化、翻译、定位和稳定性，还通过调节糖酵解、细胞凋亡和细胞增殖参与肿瘤发生。

(2)PDI：蛋白质二硫键异构酶 (PDI) 被鉴定为催化 PTB 去二聚化的酶，其依赖于 PDI 的 a' 结构域的 CGHC 活性位点, 负责内质网 (ER) 中二硫化物的形成、切割和异构化，这对蛋白质的正确折叠至关重要。PDI在许多癌症类型中高度表达，被认为是治疗癌症的潜在靶点。

结果部分：

1. PTB分别以二聚体和单体存在于细胞核和细胞质中

首先，看PTB的表达位置：

A：随机选择3个细胞系，发现核 PTB 主要以二聚体形式存在，而细胞质 PTB 主要以单体形式存在。

B-C：在 G2/M 期与诺考达唑（G2/M 期阻滞药物）处理同步的细胞在细胞裂解后表达更多的 PTB 单体，总蛋白中 PTB 二聚体的水平降低，这些变化证实了 PTB 二聚体和单体的不同定位。

结论：在有丝分裂中的细胞纯化的胞质溶胶蛋白中，存在更多的 PTB 去二聚化现象（即单体增多），但在细胞核中表达无差异。

2. 第23位aa半胱氨酸分子间的二硫键介导 PTB的二聚化

A: 将 PTB 分为四个功能结构域部分，并将它们与 GFP 融合表达，PTB 在第16位的丝氨酸 (S) 的磷酸化可介导其细胞质输出，将第16位aa丝氨酸突变为丙氨酸 (S→A) 以模拟丝氨酸去磷酸化，突变为天冬氨酸 (S→D) 或谷氨酸 (S→E) 以模拟 PTB 组成型磷酸化。

B: PTB (1-130)-GFP 组中观察到约 80K Da 的条带，表明形成二聚体，PTB (258–408)-GFP 和 PTB (409–526) 时在 80k Da 处未观察到条带-GFP 共表达.此外，在 PTB (1-130)-GFP 组中发现了两条约 40K Da 的条带,其他3个部分未观察到条带-GFP 共表达。

C：几乎所有含有核定位序列的PTB都定位于细胞核中。

E：在 PTB 的二聚化中没有观察到显著的含量差异，表明 PTB 第16位的丝氨酸的磷酸化状态不影响其二聚化。

由于半胱氨酸残基的巯基 (SH) 侧链之间形成的二硫键经常出现在蛋白质二聚体中，而第23位的半胱氨酸之间唯一的半胱氨酸。（图2A ）中，作者将第23位的半胱氨酸突变为丝氨酸（C→S）以破坏潜在的半胱氨酸介导的二硫键形成。

F-G：C23S 突变就足以完全破坏 PTB 二聚化。

结论：第23位半胱氨酸的二硫键负责 PTB 的二聚化，而第16位的丝氨酸不影响。

3. PDI 催化 PTB 的去二聚化

半胱氨酸残基之间二硫键的形成，主要发生在内质网中，是蛋白质正确折叠的限速步骤。硫氧还蛋白超家族，包括 21 个成员，催化大多数二硫键的形成、断裂和重排。

A：加入siRNA后发现发现 PDI 的沉默增强了 PTB 的二聚化。

B: PDI 的过表达并没有显著改变 PTB 二聚体和单体的比例。

C：PDI 在结构上包含四个硫氧还蛋白样结构域（a、b、b' 和 a'），它们是底物结合所必需的和一个 C 末端酸性尾，a 和 a' 结构域分别包含一个 CGHC 活性位点，负责硫醇—二硫键的交换。

D：用 NADP 或 PDI 过表达的 NADPH 处理细胞，发现添加 NADPH， 而不是 NADP 诱导 PTB 的去二聚化，表明 PDI 是一种催化 PTB 去二聚化的酶。

E：构建不同结构域的三个突变体，发现 PDI 的 a' 结构域的 CGHC 活性位点负责 PTB 的去二聚化。

结论：PDI 是一种催化 PTB 去二聚化的酶，且PDI 的 a' 结构域的 CGHC 活性位点负责 PTB 的去二聚化。

4. PTB 的去二聚化伴随着 DNA 损伤时 p53 的上调

PTB 在 DNA 损伤后从细胞核转移到细胞质。

A: HEK-293 细胞用依托泊苷 (10 μg/ml) 和多柔比星 (10 μg/ml) 处理 24 小时。PTB 和 PDI 的免疫荧光染色用 Hoechst 复染, PTB 蛋白从二聚体显著转变为单体，伴随着它在细胞质中的积累和 PDI 的表达增强。

B：p53 和 γ-H2X（DSB 处 DNA 损伤的指标）以及激活 G2/M 转变或 S 期进入的 Cyclin E 和 Cyclin B1 上调，而抑制 G1/S 转变的 Rb 被抑制。

C：另一种拓扑异构酶抑制剂阿霉素也诱导 PTB 的去二聚化和 p53 和 PDI 的上调。

D：CCF642，它特别抑制PDI的还原酶活性，显示出随着PTB单体和p53的减少，促进了PTB的二聚化。

E：HEK-293 细胞用或不用多柔比星和 CCF642 处理的结果表明抑制多柔比星处理诱导的 PTB 的去二聚化和 p53 的上调。

F：蛋白激酶 ATM 和 ATR 是关键成分，它们被募集到受损的 DNA 位点，然后激活 DNA 修复和细胞周期停滞。我们使用小分子 KU-60019 和 ETP-46464 来抑制 ATM 和 ATR 的激活，发现 PTB 的去二聚化和依托泊苷诱导的 p53 上调受到抑制。

结论：PTB 的去二聚化受 PDI 调节，并参与 DNA 损伤后的 ATM/ATR/p53 信号转导。

5. 细胞质中的 PTB 单体增强 p53 翻译

前期研究结果表明：PTB 与TP53 mRNA 的 IRES 和 3'UTR 发生物理相互作用，这表明其具有增强TP53 表达的功能。作者发现 PTB 的 C23S 突变体定位于细胞核中，因为它在 N 末端具有核定位信号。为了探索 PTB 的二聚化状态和定位是否参与 TP53 的调节，作者通过删除 N 末端核定位信号（NLS）—PTB ΔNLS-GFP进行研究。

A：HEK-293 细胞中过表达 PTB、PTB C23S（突变体） 和 PTB ΔNLS，发现只有 PTB ΔNLS 略微增强 TP53 表达。

B：敲除 PTB 以排除内源性 PTB 的影响，PTB ΔNLS-GFP 而不是 PTB-GFP 和 PTB C23S-GFP 的重新表达在敲除内源性 PTB 后逆转了 TP53 表达的抑制，表明细胞质中只有 PTB 单体增强了TP53的表达。

C：敲除 PTB 抑制了TP53的表达。

D：PTB 的敲除和重新表达不影响TP53 mRNA的含量。

E：在阻断蛋白酶体介导的蛋白质降解途径的 MG-132 存在下，PTB ΔNLS-GFP 的过表达确实促进了TP53的表达。

结论：细胞质中的 PTB 单体增强了TP53 的翻译水平，但不影响mRNA水平。

6. 细胞质 PTB 单体与核糖体蛋白相互作用

A：为了鉴定细胞质 PTB 单体的相互作用蛋白，作者随后用磁珠对 GFP 进行了 GFP 和 PTB ΔNLS-GFP 的免疫沉淀，在 SDS-PAGE 和银染之后，用质谱法表征了 8个特定区域，共鉴定出 86 种蛋白质。

B：蛋白质组学分析出 24 种核糖体蛋白质和另外 4 种蛋白质（EIF4A1、EIF4A3、EIF6 和 EEF1A1）参与蛋白质翻译的起始和延伸。[玫瑰红圈：核糖体蛋白；红圈：翻译起始或延伸因子；绿圈：线粒体核糖体蛋白]。其中 7 种蛋白质是线粒体核糖体的组成部分，一种 (TUFM) 负责线粒体蛋白质合成过程中氨酰-tRNA与核糖体A位点的结合。

C：核糖体 40S 亚基的RPS6 被证实是 PTB ΔNLS 的相互作用伙伴。

结论：核糖体和线粒体核糖体相关的细胞质PTB单体在蛋白质翻译中起重要作用。

好啦，本期的精品文献导读就到这里

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