Nat Commun. (Q1，14.919) | USP22通过稳定肝细胞癌中的PPARγ调节脂质积累

文章名称：USP22 regulates lipidome accumulation by stabilizing PPARγ in hepatocellular carcinoma

发表期刊：Nature Communications

影响因子：14.919

发表时间：2022年

发表单位：中国科学院大连化学物理研究所

样品类型：Ten pairs of HCC (6 female and 4 male patients, the age range is between 48 and 60) samples，Human HCC cell lines MHCC-97H, HUH7, Bel-7402, Hep3B, HepG2, SMMC-7721, THLE-2, SNU449. HEK-293T.Pathogen-free male athymic nude mice (4–5 weeks old, 18–22 g).

运用技术：克隆形成，细胞增殖，免疫组化，核质分离，去泛素化，DNA结合活性，GST-pulldown，荧光素酶报告基因，甘油三酯检测，油红O染色，免疫荧光，RT-PCR，RNA测序，ChIP seq，代谢和脂质组，MS。

研究背景

肝脏是糖、脂质和蛋白质等代谢的关键器官。在各种肝脏疾病，包括肝细胞癌(HCC)，都与代谢异常有关，，全球HCC发病率正在迅速增加，部分原因是肥胖症普遍及随后代谢相关脂肪肝疾病(MAFLD)发生。全球HCC的发病率正在迅速增加，部分原因是肥胖的流行以及随后代谢相关脂肪肝疾病(MAFLD)的发展和进展。更重要的是，富含脂质是肥胖和MAFLD驱动的HCC发生发展的的重要特征之一。

从头脂肪生成(DNL)升高是MAFLD和癌症（包括HCC）的关键诱因之一。脂肪酸从头合成的异常增加是DNL的关键环节之一。脂肪酸和脂质组作为关键的信号因子、能量来源和细胞膜的组成部分，在细胞增殖中起关键作用

代谢酶表达或活性的失调是代谢重编程的关键原因之一。泛素化和去泛素化是代谢酶的关键翻译后修饰，它们通过标记或去除底物蛋白中的泛素来调节它们在细胞中的降解。泛素化和去泛素化失调与细胞脂质代谢密切相关，促进包括HCC在内的多种癌症的发生和发展。USP22是一种癌症特征基因，在多种癌症中高度表达。USP22主要通过从组蛋白（H2B和H2A）中去除泛素，在染色质重塑中发挥癌蛋白的作用，随后激活或稳定癌症进展。然而，尚未确定USP22是否调节脂肪生成。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一种配体激活的转录因子，通过上调脂质合成酶（包括ACC、ACLY和FASN）促进脂肪生成，作为转录因子的PPARγ可促进肝癌中脂肪生成和有氧糖酵解的代谢适应。然而，PPARγ在癌症生物学中的上游作用尚不清楚。

重要结果

     1. HCC脂质代谢异常与USP22显著相关

作者采用非靶向代谢组学方法对HCC的癌和癌旁组织进行分析，发现与癌旁组织相比，癌组织中共有47个代谢物发生了显著改变，其中上调代谢物主要是脂质和类脂分子（22/26）。KEGG通路分析表明癌组织中的差异代谢物主要参与脂质生物合成。进一步对癌和癌旁组织中的泛素特异性蛋白酶(USPs)进行分析，发现USP22表达最高，且与脂质和类脂分子上调显著相关，表明USP22可能参与HCC癌组织中的脂质生物学合成。

    2. USP22 促进HCC细胞脂质积累

作者分别构建了USP22敲低和过表达细胞系，通过代谢组学分析共获得53个差异代谢物，其中34个代谢物表达趋势相反，主要参与脂肪酸合成途径。采用代谢流分析脂肪酸的合成过程，发现USP22敲低细胞中棕榈酸和硬脂酸标记显著降低，而过表达细胞中标记显著增加。并且USP22过表达细胞中甘油三酯显著增加。表明USP22在肝细胞脂质含量积累中发挥关键作用，并可能促进肝细胞中脂肪酸的从头合成。进一步通过转录组学、qPCR和WB分析发现USP22可以通过脂肪酸合成关键酶ACC和ACLY的转录上调促进脂肪酸从头合成从而积累脂肪酸。

图2 USP22通过ACC和ACLY的转录上调促进脂质积累

     3. USP22通过与PPARγ相互作用调控ACC和ACLY转录

作者通过IP-MS发现USP22的潜在底物PPARγ——脂质代谢转录因子。此外，在MHCC-97L、HUH7、HepG2、SNU449和Bel-7402细胞中同样发现了USP22的靶蛋白PPARγ。体外pull down实验再次验证了USP22与PPARγ的直接相互作用。免疫荧光染色结果显示USP22和PPARγ主要定位于肝癌细胞的细胞核。

图3 USP22与脂质代谢关键转录因子PPARγ相互作用

接着，作者进一步通过去泛素化实验发现，USP22敲低细胞中PPARγ多泛素化水平显著升高，而USP22过表达细胞中PPARγ去泛素化作用增强。体外实验也证明USP22可以显著促进PPARγ去泛素化。并且赖氨酸-169可能是USP22调控PPARγ去泛素化的重要位点。

图4 USP22的去泛素化作用

     4. USP22通过PPARγ上调ACC和ACLY参与HCC肿瘤发生

敲低PPARγ或ACC后，葡萄糖示踪剂对脂肪酸的标记显著降低；而回补PPARγ显著增加了USP22敲低细胞中脂肪酸标记。此外，油红染色也证实了TG的积累趋势。表明USP22通过稳定PPARγ上调脂肪酸的生物合成。

进一步进行异种移植瘤分析，发现过表达USP2的小鼠肿瘤更大；而同时过表达USP22并敲除PPARγ、ACC或ACLY的小鼠肿瘤生长速度较慢。过表达USP22的肿瘤中PPARγ、ACC和ACLY表达上调；过表达PPARγ可以恢复USP22敲低细胞中ACC和ACLY的表达。表明过表达USP22可以通过PPARγ介导的ACACA和ACLY的表达激活体内脂肪酸信号的从头合成。

图5 USP22通过PPARγ上调ACC和ACLY参与HCC的肿瘤发生

     5. USP22-PPARγ/ACC/ACLY与肝癌预后不良显著相关

IHC分析显示肝癌TMAs中USP22的表达与PPARγ、ACC或ACLY的表达呈正相关。并且USP22或PPARγ水平较高的患者总生存期较短；USP22和PPARγ水平均高的患者总体生存期更差。进一步利用TCGA数据集明确了USP22、PPARγ、ACC和ACLY的高表达与HCC患者不良预后的显著相关性。

图6 USP22-PPARγ/ACC/ACLY轴与肝癌预后显著相关

原文总结

从头合成的脂肪酸被认为是肝细胞癌(HCC)发展的关键因素，本研究作者利用转录组、代谢组和IP-MS等方法，发现泛素特异性蛋白酶22(USP22)是脂肪酸从头合成的关键调控因子，通过直接与PPARγ相互作用介导ACLY/ACC的表达调控脂肪酸从头合成，它直接与去泛素化酶相互作用并通过K48连接的去泛素化稳定过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)，该稳定导致乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）的表达增加。此外，我们发现USP22促进脂肪酸从头合成并有助于HCC肿瘤发生，在体内实验中发现，通过抑制PPARγ、ACLY或ACC的表达能抑制致瘤性。在HCC中，USP22的高表达与PPARγ、ACLY或ACC表达呈正相关，并与预后不良相关。总之，我们确定了一种USP22调节的脂肪生成机制，该机制涉及HCC肿瘤发生中的PPARγ-ACLY/ACC调控轴，并为通过USP22抑制治疗靶向脂肪生成提供了理论依据。